Dissezione del rene Zebrafish adulti

1. La dissezione del rene adulto zebrafish da un campione animale unfixed Selezionare un zebrafish adulti tra i 3-6 mesi di età per la dissezione. Euthanize il pesce mettendolo in un piatto con il 0,2% Tricaine pH 7,0 per circa 4-5 minuti, guardando con attenzione per vedere che le branchie si fermano e il cuore smette di battere. Con un cucchiaio, sollevare il pesce dal bagno Tricaine in una piccola quantità di soluzione, decantare la soluzione e delicatamente posto l'animale su un tovagliolo di carta. Utilizzare un paio di forbici affilate dissezione per rimuovere la testa dell'animale, effettuando un taglio subito dietro l'opercolo branchiale (Figura 1, percorso A). Scartare la testa in un contenitore per rifiuti a rischio biologico. Utilizzare le forbici dissezione per aprire il corpo dell'animale, facendo una lunga incisione ventrale, a partire dalla testa e chiude in coda alla base della pinna caudale (Figura 1, percorso B). Rimuovere gli organi interni dell'animale utilizzando un paio di pinzette dissezione / pinze, e metterli in rifiuti biologici. Fare attenzione a non spazzolare la parete dorsale del corpo, in quanto questa è la posizione del rene (Figura 2). Se è stato selezionato un pesce femmina, sarà necessario raccogliere le uova sviluppo fuori della cavità del corpo, che può essere più facile da fare usando una coppia di pinze ad angolo o una pinzetta. Utilizzare aghi dissezione al pin aprire le pareti del corpo di un vassoio di dissezione, e l'angolo i perni in modo che il rene possono essere visualizzati. Il rene possiede una forma caratteristica (testa, tronco / sella, coda) e colore, si alternano con pigmentazione color nero (Figura 2). Si può anche vedere l'aorta pieno di sangue periferico, che corre lungo la linea mediana della struttura dell'organo. Utilizzare una pinza sottile per staccare il rene dalla parete dorsale del corpo, utilizzando un paio di pinze per sollevare il rene come organo separato dal tessuto connettivo che ne sono alla base. Posizionare con delicatezza il rene nel veicolo desiderato per ulteriori studi sulle cellule vive, come una provetta contenente PBS 1x per la preparazione FACS. 2. Preparazione e dissezione del rene adulto zebrafish da un campione di animali fisso Preparare una soluzione del 4% PBST paraformaldehyde/1X. Far bollire la soluzione per sciogliere il PFA in soluzione, poi raffreddare il composto a 4 ° C e aggiungere 0,1% dimetilsolfossido. Abbiamo avuto più successo con la conservazione dei tessuti da usare appena fatto soluzioni PFA al contrario di aliquote congelate. Preparare la soluzione sufficiente per immergere il pesce zebra adulto durante la dissezione. Riempire un vassoio di dissezione con una soluzione di fissaggio sufficiente per immergere il pesce zebra adulto durante la dissezione. Eseguiamo i passaggi successivi con questo vassoio posizionato sotto il microscopio, che può essere collocato in una cappa chimica per minimizzare l'esposizione agli odori fissazione. Selezionare un zebrafish adulti tra i 3-6 mesi di età per la dissezione. Euthanize il pesce mettendolo in un piatto con il 0,2% Tricaine pH 7,0 per circa 5 minuti, guardando con attenzione per vedere che le branchie e smettere di battere il cuore. Con un cucchiaio, sollevare il pesce dal bagno Tricaine in una piccola quantità di soluzione, decantare la soluzione e delicatamente posto l'animale su un tovagliolo di carta. Utilizzare un paio di forbici affilate dissezione per rimuovere la testa dell'animale, effettuando un taglio subito dietro l'opercolo branchiale (Figura 1, percorso A). Scartare la testa in un contenitore per rifiuti rischio biologico, e subito posto l'animale in PFA-vassoio contenente dissezione. Utilizzare le forbici dissezione per aprire il corpo dell'animale, facendo una lunga incisione ventrale, a partire dalla testa e chiude in coda alla base della pinna caudale (Figura 1, B percorso), e mantenere il corpo parzialmente sommerso durante la procedura. Rimuovere gli organi interni dell'animale utilizzando un paio di pinzette dissezione / pinze, e metterli in rifiuti biologici. Fare attenzione a non spazzolare la parete dorsale del corpo, in quanto questa è la posizione del rene (Figura 2). Utilizzare aghi dissezione al pin aprire le pareti del corpo, e l'angolo i perni in modo che il rene possono essere visualizzati. Il rene possiede una forma caratteristica (testa, sella, coda) e colore, si alternano con pigmentazione color nero (Figura 2). Si può anche vedere l'aorta pieno di sangue periferico, che corre lungo la linea mediana della struttura dell'organo. Fissare il campione durante la notte, mettendo il vassoio a 4 ° C quando si è fatto a organizzare i campioni desiderati. Il giorno successivo, rimuovere la soluzione PFA dal vassoio e sostituirlo con 1x PBST. Utilizzare una pinza sottile per staccare con cura il rene dalla parete dorsale del corpo, utilizzando un paio di pinze per sollevare il rene come organo separato dal tessuto connettivo che ne sono alla base. Il tessuto renale sarà morbida e flessibile dal DMSO nella soluzione di fissativo, che consente di sezionare l'intero organo rene in un unico pezzo. Utilizzare un ampioforo pipetta di trasferimento per posizionare il rene in una provetta. Il rene può essere ulteriormente elaborato per condurre montare istologica o intero negli studi di espressione genica in situ sulla base dello studio desiderato. 3. Rappresentante dei risultati: I passi che vengono rappresentata nella Figura 1 indicano la procedura di dissezione. Il rene può essere identificato in base alla sua caratteristica forma e colorazione, e la posizione anatomica sulla parete dorsale della cavità del corpo dell'animale, come mostrato nella Figura 2. Dopo la dissezione di un campione fisso rene, montare tutto ibridazione in situ possono essere utilizzate per localizzare l'espressione di un gene di interesse, come mostrato nella Figura 3. Figura 1: Procedura che consente l'accesso diretto per sezionare il pesce zebra rene adulto. (A) zebrafish eutanasia è sezionato in modo graduale (indicato da numeri e frecce) per dare al ricercatore il più facile accesso al rene organo completo. Le immagini della cavità addominale prima (B) e dopo (C) la rimozione degli organi addominali. Figura 2:. Visualizzazione del rene zebrafish in un campione unfixed dopo la rimozione di organi nella cavità del corpo, il rene appare come un unico organo appiattito che è aderente alla parete dorsale del corpo attraverso i tessuti connettivi (A), ed è stato schematizzato (B) per mostrare la sua forma anatomica. Figura 3: montare intero ibridazioni in situ effettuata su tutto l'organo rene adulto. (A) cadherin17 trascrizioni vengono rilevati nel tubulo di nefroni rene adulto, ampliato nel (A '). (B) trascrizioni mafba sono localizzate nefrone prossimale tipi di cellule nel rene adulto (confronta con tubulo intero pannello A). (B' ) Una visione allargata di espressione mafba rivela che le trascrizioni sono specificamente localizzati al podociti (P), le cellule del sangue filtro (glomerulo) e contorto tubulo prossimale (PCT).