1. Перехват Дак и клоаки Свабирование Ловушка речные утки рода Anas (или другой птицы) в клетке за счет привлечения их заманить уток или продуктов питания, и поместить их в отдельные коробки плате карты. Транспорт раз в соответствующем окне должно быть сведено к минимуму, например, путем установки полевая станция находится на небольшом расстоянии к ловушке. Логистическая обстоятельства могут меняться в каждом исследовании. Советы и утверждения соответствующих животных комитета по этике должна быть искали для каждой новой установки. Кроме того, также охотник выстрелил птицы могут быть отобраны. Возьмите утку из коробки, удерживая ее крылья плотно прилегает к его телу. Пример свежий снижается, которая будет присутствовать в большинстве случаев, непосредственно из нижней части окна. Забрать их стерильным тампоном и нанесите жидкость для карт ватмана ССТ. Если нет, выполните клоаки моечные. Включите утку на спину. Это дает возможность доступа к клоаке и облегчает отбор проб. Клоаки выступающие структура расположена ниже живота, ближе к основанию хвоста. Опытный человек мог держать и образцы птицы в то же время, или же второй человек может помочь. Осторожно вставьте стерильные пластиковые района тампоном (Копан, Италия) около 1 см и сделать нежным вихрем клоаку. Ролл тампон жидкостей из клоаки по поверхности карты ватмана ССТ. После отбора проб был выполнен немедленно освободить животное является желательным. Сухой FTA карт при комнатной температуре не менее 1 часа, затем сохранить каждый образец индивидуально в бумажных пакетах (например, конверты). Хранение можно при комнатной температуре, возможно, с бисером кремнезема во влажном климате. Отправка и получение биобезопасности учреждений офицеры могут позволить отправить FTA карты по почте, так как возбудители становятся неактивными при контакте с поверхностью карты ЗСТ. 2. Вирусный изоляции РНК Извлечение материала FTA карты, включая фекалии / клоаки жидкость. Удар три диска с Харрисом 2 мм перфоратор и место всех тех, в скважины пластины РНКазы свободной 96well. Между каждым нового образца, чистый панчер осторожно с алкоголем и точность Ким протрите (KIMTECH). Всегда используйте положительные и отрицательные контроли. Положительного контроля может состоять из лабораторного штамма свеженанесенный на карту зоны свободной торговли, или природном образце которого знаете, получая положительный результат. Как отрицательный контроль, выбивать диски из пустой картой ЗСТ. Кроме того, оставьте другой хорошо бесплатным для контроля ПЦР позже в эксперименте (с водой как шаблон). Добавить 70μl РНК быстрой экстракции раствором (Амбион) и рулонн пластины (AbGene Термо-Sealer). Выдержите 5 минут на планшетном шейкере при комнатной температуре определяется скоростью, которая не вызывает перелив (это зависит от используемой модели пластины шейкер; тест заранее). Проведение вирусных РНК изоляции в соответствии с протоколами производителя с MagMAX-96 вирусных РНК изоляции комплект (Амбион). Вкратце: Добавить 130μl подготовлены лизиса / обязательные решения (из комплекта) в каждую лунку. Передача 50 мкл извлеченные FTA карты материала в каждую лунку. Встряхните пластины на 1 минуту. Добавить 20 мкл подготовленных шарик смеси (из комплекта) для каждого образца и перемешать с помощью пипетки вверх и вниз. Встряска на определенные скорости в течение 5 минут. Молекулы РНК связываются с магнитными бусами. Перемещение пластины для магнитного 96-луночного стоять, чтобы захватить бисером. В зависимости от модели магнитной стенд используется, это может занять более 5 минут. Когда раствор получился совершенно ясно, удалить и уничтожить супернатант. Затем удалить пластину из магнитного стенда. Вымойте бисером дважды промывочного раствора 1 и дважды промывочного раствора 2 (из комплекта). Для каждого из 4 шагов мыть добавить 150 мкл приготовленного раствора мыть к каждой пробе, встряхивать в течение 1 минуты определяются скорость, перемещение пластины магнитного стенд, захват бисером в течение приблизительно 5 минут (или пока раствор не вполне ясно), удалять и отбросить супернатант. Затем удалить пластину из магнитного стенд, добавить следующее решение мыть, и проводить промывки, как раньше. После последней промывки, удалить как можно больше моющего раствора, как это возможно и сухой воздух бисером при комнатной температуре в планшетном шейкере в течение 2 минут. Добавить 50 мкл буфера элюирования (из комплекта), чтобы освободить РНК из бисера и встряхивают в течение 4 минут на пластину шейкер. Захват бисером, как описано выше. Супернатант теперь содержит изолированных РНК, которая готова для последующих применений. 3. RT-PCR из ВГП Матрица Гена Провести обратной транскрипции ПЦР (RT-PCR) с One-Step доступа RT-PCR системы (Promega) в 25 мкл реакции (в диапазоне от Краус и др. 18 и Fouchier и др. 22..): Нуклеазы свободной воды 1.5μl AMV / Tfl5 буфер </td> 5 мкл дНТФ 0.5μl Грунтовка M52C 22 (10 мкм) 2.5μl Грунтовка M253R 22 (10 мкм) 2.5μl MgSO 4 (25 мМ) 7μl AMV обратной транскриптазы (5u/μl) 0.5μl TFL полимеразы (5u/μl) 0.5μl РНК образца 5 мкл Условия ПЦР в Biometra T1 амплификаторе являются: начальный обратной транскрипции 45 минут при 45 ° C, затем 2 минуты начальная денатурация при 94 ° С и 40 циклов: 94 ° С в течение 1 минуты, 56 ° С в течение 1 минуты, а 68 ° С в течение 2 минут. Дополнительное удлинение 7 минут при 68 ° C заключает усиления. 4. Скрининг на АИ-положительные образцы и очистки целевых фрагментов из геля Нагрузка 2μl продукта ПЦР смешанного с 5x 2μl красителя нагрузки (BioRad) и 6μl воды на 1% агарозном геле (Roche) окрашивали 1% этидия бромид (2.5μl на 100 гель мл) для предварительного отбора. Выполнить гель течение 1 часа при 120 В, наряду со стандартным размером ДНК (BioRad EZ нагрузка 100 б.п. лестнице), визуализировать с документацией по системе гель. Смотрите пример на рисунке 1. Выберите образцы с амплифицированных фрагментов в ожидаемый диапазон размеров (от 200 б.п. и 300 б.п. (целевой фрагмент 244 пар оснований). Нагрузки всей реакции ПЦР объем (из которых ~ 23μl осталось) из этих кандидатов с 5-кратным 6μl красителя нагрузки на 2 бромид этидия% агарозном геле, окрашивали и запустить в течение 2 часов. Место гель на УФ-transilluminator (Bioblock Scientific) и осматривается. Смотрите пример на рисунке 2. Акцизный полосы нужного размера из геля с помощью скальпеля и помещены в отдельные пробирки на 1,5 мл реакции. Purify фрагментов из геля, например, с Zymoclean ДНК гель Восстановление Kit (Zymo исследований). 5. Секвенирование и идентификации продуктов ПЦР Провести Сэнгер секвенирования целевой фрагменты, например, на ABI 3730 капиллярной секвенсор с ABI Большой Dye 3,1 химия (Applied Biosystems). Подготовка последовательность реакций в 10 мкл томов, содержащих 10-20 нг гель-очищенной шаблон кДНК, 1.75μl 5x буфера разбавления, 0.5μl Большой Dye V3.1 премикс, 1 мкл прямого праймера (M52C 20, 10 мм), а ddH2O. Велоспорт условиями являются: 1 мин начальной денатурации, после 25 циклов: 10 секунд при 96 ° С, 5 с при 45 ° С и 4 мин при 60 ° C. Purify и подготовить последовательность реакций в соответствии с вашими внутренними протоколами. Определить результате кДНК против нуклеотидных баз данных, таких как GenBank23, например, веб-инструменты, такие как взрыв на Национальный центр биотехнологической информации (NCBI, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ). 6. Представитель Результаты: Кряквы (Anas platyrhynchos) были отобраны на Ottenby Птица обсерватории в декабре 2007 года. От каждого кряква образца на FTA карта была взята, как описано в данном протоколе. После доставки, FTA карты хранились в морозильнике при температуре -20 ° С в течение двух лет. Же карта FTA образец лаборатории изолировать испытания в Краус и соавт. 18 был включен в качестве положительного контроля, а также девять десятикратно серийные разведения его. Два отрицательных контролей были я) извлечение из пустых карт FTA, чтобы проверить, есть ли перенос средств с нокаутером, и б) RT-PCR реакции, в которой нуклеазы свободной воды был использован в качестве шаблона, чтобы проверить, если заражение произошло во время или в подготовке реакции ПЦР. 84 образцов были проанализированы. Гель картину продуктов ПЦР из этих 84 образцов можно найти на рисунке 1. Из натуральных образцов множества неспецифических полосы можно наблюдать из-за наличия различных примесей микроорганизмов в фекалиях. Тем не менее, целевой фрагмент пары праймеров составляет 244 б.п. долго. Весь ПЦР-реакции объема подмножество образцы, которые производятся фрагменты примерно правильный диапазон размеров (от 200 б.п. и 300 б.п.) был загружен на гель (рис. 1). Иллюстрация того, какие из полос, вырезанных из геля можно найти в дополнительном рисунке 1. В дополнение к положительным контролем, два из этих образцов (69899 и 69912) были положительны на новый протокол. BLAST поиска по базе данных NCBI нуклеотидных установлена ​​личность, как А. И. матрицу гена (рис. 3), тогда как все другие группы напоминали бактериальных последовательностей, наиболее тесно, или не дали последовательность читается на всех. Рисунок 1. Гель картину предварительный отбор продуктов ПЦР. 2 мкл продукта ПЦР положительный контроль, зПерс разведений положительного контроля, два отрицательных контролей и 84 клоаки образцы были загружены. 48 образцов представлены в верхней панели гель, и 48 образцов в нижней панели. Красные стрелки указывают геля полосы для 100 б.п. стандартного размера ДНК. Для иллюстрации, красные кружки полосы ожидаемого размера диапазона. Синие кружки неспецифической ампликона (вверху слева) или артефакт грунтовки димера ниже 100 б.п. по размеру (внизу справа). Рисунок 2. Отбор образцов с фрагментами в правильном диапазоне размеров. Образцы с полос частот между 200 б.п. и 300 б.п. (целевой фрагмент 244 пар оснований) были выбраны. Зеленая стрелка указывает на положительный контроль, две красные стрелки указывают образцов, которые были подтверждены быть AIV положительные путем сравнения их кДНК последовательностей нуклеотидных NCBI базе данных. Рисунок 3. Экран захвата представитель поиска BLAST в NCBI. Одной из кДНК последовательностей, полученных от вырезали фрагменты Был задан вопрос в отношении нуклеотидных баз данных на веб-сайте NCBI. Образец правильно определил, как А. И. фрагмента гена Matrix. Для просмотра полную версию этого изображения, нажмите здесь. S1 Дополнительный рис. Полосы отобранных образцов вырезали из геля. Эта фотография была сделана из геля, изображенный на рис 1 после кандидатом полос частот между 200 б.п. и 300 б.п. были вырезаны.