एवियन इन्फ्लुएंजा निगरानी के साथ मुक्त व्यापार समझौते कार्ड: फील्ड तरीके, जैवसुरक्षा, और परिवहन मुद्दे का हल
Summary
को बनाए रखने के लिए, पता लगाने के लिए और अनुक्रम एवियन इन्फ्लुएंजा वायरस से शाही सेना के लिए एक विधि मान्य और पक्षियों से प्राकृतिक मल के नमूने का उपयोग करते हुए विस्तारित किया गया था. इस तकनीक में एक शांत श्रृंखला और संक्रामक वायरस के संचालन को बनाए रखने की आवश्यकता को हटा और एक 96 अच्छी तरह से उच्च throughput सेटअप में लागू किया जा सकता है.
Abstract
Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral subtypes2. Human pandemics of flu originally stem from AIVs3. Many fatal human cases during the H5N1 outbreaks in recent years were reported. Lately, a new AIV related strain swept through the human population, causing the ‘swine flu epidemic’4. Although human trading and transportation activity seems to be responsible for the spread of highly pathogenic strains5, dispersal can also partly be attributed to wild birds6, 7. However, the actual reservoir of all AIV strains is wild birds.
In reaction to this and in face of severe commercial losses in the poultry industry, large surveillance programs have been implemented globally to collect information on the ecology of AIVs, and to install early warning systems to detect certain highly pathogenic strains8-12. Traditional virological methods require viruses to be intact and cultivated before analysis. This necessitates strict cold chains with deep freezers and heavy biosafety procedures to be in place during transport. Long-term surveillance is therefore usually restricted to a few field stations close to well equipped laboratories. Remote areas cannot be sampled unless logistically cumbersome procedures are implemented. These problems have been recognised13, 14 and the use of alternative storage and transport strategies investigated (alcohols or guanidine)15-17. Recently, Kraus et al.18 introduced a method to collect, store and transport AIV samples, based on a special filter paper. FTA cards19 preserve RNA on a dry storage basis20 and render pathogens inactive upon contact21. This study showed that FTA cards can be used to detect AIV RNA in reverse-transcription PCR and that the resulting cDNA could be sequenced and virus genes and determined.
In the study of Kraus et al.18 a laboratory isolate of AIV was used, and samples were handled individually. In the extension presented here, faecal samples from wild birds from the duck trap at the Ottenby Bird Observatory (SE Sweden) were tested directly to illustrate the usefulness of the methods under field conditions. Catching of ducks and sample collection by cloacal swabs is demonstrated. The current protocol includes up-scaling of the work flow from single tube handling to a 96-well design. Although less sensitive than the traditional methods, the method of FTA cards provides an excellent supplement to large surveillance schemes. It allows collection and analysis of samples from anywhere in the world, without the need to maintaining a cool chain or safety regulations with respect to shipping of hazardous reagents, such as alcohol or guanidine.
Protocol
Discussion
यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल एक अनुपूरक विधि AIV की उपस्थिति के लिए मल या इसी तरह के नमूने स्क्रीन प्रदान करता है. यह विशेष रूप से नमूना संग्रह त्वरित और आसान बनाने के लिए डिजाइन किया गया था. यह शिकारी या वन्यजीव प्रबंधकों जैसे कम प्रशिक्षित व्यक्तियों, ऐ निगरानी के लिए योगदान के लिए यह संभव बनाता है. नहीं शांत श्रृंखला के लिए लागू किया जाना चाहिए, हालांकि नमूने ठंड जहां संभव हो सिफारिश की है. कमरे के तापमान के कुछ दिनों के, उदाहरण के लिए प्रयोगशाला में परिवहन के दौरान मुक्त व्यापार समझौते कार्ड पर शाही सेना अणु के लिए एक समस्या नहीं थे, के रूप में लंबे समय के रूप में कार्ड शुष्क बने रहे. अन्य गैर ठंडा भंडारण प्रणालियों है कि वर्तमान में अनुसंधान समुदाय द्वारा मूल्यांकन कर रहे हैं 15 शराब या guanidine 16 के रूप में, अपने खतरनाक प्रकृति की वजह से से विशेष शिपिंग व्यवस्था की आवश्यकता है. इसके विपरीत, मुक्त व्यापार समझौते कार्ड विधि खतरनाक सामग्री की शिपिंग आवश्यकता नहीं है. हालांकि, इस संबंध में एक और दिलचस्प भंडारण माध्यम RNAlater ™ है कि खतरनाक नहीं है, 17 या तो है. किसी भी मानक आणविक प्रयोगशाला में नमूना विश्लेषण किया जा सकता है. कोई विशेष सामान्य प्रतिक्रियाओं पीसीआर और केशिका अनुक्रमण के लिए की तुलना में अन्य उपकरणों की जरूरत थी. सभी चरणों का एक जैव सुरक्षा स्तर के बिना बाहर किया जा सकता है क्योंकि नमूना संग्रह पर पहले से ही संभावित रोगजनक एजेंटों एफटीए कार्ड के जीवाणुरोधी और antiviral गतिविधि के द्वारा निष्क्रिय किया गया.
क्रॉस संदूषण और बाद में झूठी सकारात्मक नमूने हमारे परीक्षणों में जंगली पक्षियों के नमूनों के साथ मनाया गया. हालांकि, जब शाही सेना और पीसीआर के साथ काम कर रहे यह हमेशा उचित है पर विशेष ध्यान देना करने के लिए स्थानों और पूर्व और बाद पीसीआर के चरणों के लिए अलग कमरे काम कर साफ. एक धूआं हुड में कार्य प्रयोगशाला में एयरोसोल संदूषण का जोखिम कम हो जाती है. Pipetting बाहर फिल्टर सुझावों के साथ किया जाना चाहिए.
एक साथ एक ही बतख हम जानते हैं कि 84 नमूनों की छह पारंपरिक RealTime द्वारा सकारात्मक RT-पीसीआर 24 विधि और RealTime RT-पीसीआर से सीटी मान जाना जाता है थे से ली गई नमूनों पर पिछले एक अध्ययन से. दो सकारात्मक नमूने हमारे बतख है जो सीटी <30 (वायरल शाही सेना के एक उच्च एकाग्रता का संकेत) मान से स्टेम विधि द्वारा पता लगाया. अन्य चार नमूने जो पारंपरिक प्रोटोकॉल के साथ सकारात्मक थे सीटी मूल्यों> (कम केंद्रित) 30 और हमारे प्रोटोकॉल द्वारा नहीं पाया जा सकता था.
अपेक्षाकृत उच्च वायरस titers के साथ केवल नमूने हमारी परख में सकारात्मक थे और यह संभावना है कि विधि की संवेदनशीलता के लिए सभी सकारात्मक नमूनों का पता लगाने की विफलता के स्रोत था. इसके अलावा, वर्तमान अध्ययन में नमूने का आकार बहुत कम था और विधि पूरी तरह से विकसित किया जा मूल्यांकन अगर अधिक नियंत्रित और कठोर प्रयोगों बाहर किया जाता है. हालांकि, अगर इन नमूनों को एक दूरदराज के इलाके से एकत्र किया गया होता है, पारंपरिक विश्लेषण संभव बिल्कुल नहीं होता. इसके अतिरिक्त, इन पहला परिणाम पायलट प्रयोगों जो आगे अनुकूलन की जरूरत है से स्टेम. नमूना संग्रह के बाद एक नियमित रूप से -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में दो साल के भंडारण की एक अवधि शायद भी वायरल शाही सेना की गुणवत्ता से प्रभावित है. यह संभव आरएनए गिरावट एक महत्वपूर्ण मुद्दा है जब कमरे निष्क्रिय वायरस के तापमान भंडारण के साथ काम कर. वैकल्पिक तरल पदार्थ में जमा के रूप में उपर्युक्त नमूने महत्वपूर्ण गिरावट है जो वायरल जीनोम 16 की लंबी हिस्सों के विश्लेषण के प्रभावों से पीड़ित हैं. हालांकि हमारे अध्ययन में परीक्षण नहीं किया है, मुक्त व्यापार समझौते कार्ड को अच्छी तरह से अन्य आरएनए प्रणाली है कि बहुत एवियन इन्फ्लुएंजा 25 वायरस, 26 के लिए इसी तरह की हैं बरकरार शाही सेना अणु संरक्षित करने के लिए अनुकूल साबित किया है.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Bert Dibbits for technical assistance. The Animal Breeding and Genomics Group, Wageningen University, The Netherlands, generously hosted us in their laboratory. The personnel of the Ottenby Bird Observatory, Sweden, is thanked for trapping and sampling the mallards, in particular Magnus Hellström, Marcus Danielsson, Christopher Magnusson and Stina Andersson. We thank Sanne Svensson, Jonatan Qvist and Per-Axel Gjöres for filming at Ottenby, and Mano Camon for filming in the lab. Daniel Bengtson provided beautiful duck photographs for the video portion of this publication. Further free material from the CDC Public Health Image Library (PHIL; http://phil.cdc.gov/phil/) was used: The electron micrograph (no. 280; by Dr. Erskine Palmer) and illustration (no. 11823; by Douglas Jordan) of the influenza virus. Financial support was given by the KNJV (Royal Netherlands Hunters Association), the Dutch Ministry of Agriculture, the Faunafonds and the Stichting de Eik Trusts (both in The Netherlands), the Swedish Research Council (grant no. 2007-20774) and the EC-founded Newflubird project. RNA isolation chemicals were a generous gift of Ambion, Inc, the RNA company. This is contribution No. 245 from the Ottenby Bird Observatory.
Materials
| Name of the reagent or instrument | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Plastic rayon dry swab | Copan, Italy | 167KS01 | |
| FTA card | Whatman | several options | |
| Harris micro punch 2mm with mat | Whatman | 1154409 | |
| RNase free 96well plate | Greiner Bio-One | 652290 | or comparable |
| Kim precision wipes | Kimtech | 75512 | |
| RNA rapid extraction solution | Ambion | AM9775 | |
| MagMAX-96 viral isolation kit | Ambion | AM1836 | |
| One-Step Access RT-PCR system | Promega | A1250 | or comparable |
| Agarose MP | Roche | 1388991001 | multi purpose agarose |
| 5x loading buffer | BioRad | delivered with DNA ladder | |
| EZ load 100 bp ladder | BioRad | 170-8353 | or comparable |
| Ethidium bromide 1% | Fluka | 46067 | or comparable |
| 1.5ml reaction tubes | Eppendorf | or comparable | |
| Zymoclean Gel DNA recovery kit | Zymo Research | D4001 | or comparable |
| ABI big dye 3.1 chemistry | Applied Biosystems | or comparable |
References
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