Quantificação de Proteínas Usando Enriquecimento imunoafinidade Peptide Acoplado com Espectrometria de Massa

Procedimento experimental: O ensaio requer peptídeos sintéticos e anticorpos anti-peptídeo. Peptídeos selecionados deve ser exclusivo para a proteína de interesse, conter entre 8 e 22 aminoácidos, e não tem conhecido modificações pós-translacionais. Resíduos de metionina são geralmente evitada e peptídeos contendo aminoácidos dibásicos (por exemplo, KK, KR, RR) são indesejáveis. Para esta técnica, é comum o uso de peptídeos isótopo estável rotulados como normas internas, incorporando pesado (13 C e 15 N) marcado aminoácidos no C-terminal do peptídeo (ou seja, K ou R rotulados). O protocolo a seguir descreve um teste desenvolvido para medir a GDSLAYGLR peptídeo da proteína Osteopontina mouse, utilizando anticorpos anti-peptídeo obtido a partir de Epitomics Inc. (Burlingame, CA) e peptídeos sintéticos da Nova Inglaterra Peptide (Gardner, MA). O protocolo consiste em três etapas principais (Figura 1): 1) Tripsina digestão das proteínas complexas, 2) Enriquecimento de peptídeos 3) Análise por espectrometria de massa. Será demonstrado em uma amostra de plasma humano enriquecida com a proteína Osteopontina mouse. 1. Tripsina digestão enzimática e limpeza Thaw 10 mL alíquota plasma puro em gelo molhado. Determinar a concentração de proteínas totais por ensaio BCA e centrifugar a amostra para remover quaisquer sólidos em suspensão. Pipeta alíquota de 10 L de seu tubo de armazenamento para uma placa Deepwell 1000 mL e cubra com pierce-able filme. Adicionar 20 mL de 9M fresco uréia / 30mm ditiotreitol (DTT) (final de concentração 6M TDT uréia / 20mm) para cada amostra. Incubar por 30 minutos a 37 ° C. Adicionar 3 mL de iodoacetamida mM fresco 500 (IAM final de 50 mM) para cada amostra. Incubar por 30 minutos no escuro à temperatura ambiente. Adicionar 257 mL de 100 mM Tris (pH 8) (dilui uréia para 0,6 M ~). Adicionar 10 mL de tripsina solução estoque (1 mg / mL; para 01:50 enzima: substrato). Incubar 37 ° C durante a noite (12-16 horas). Adicionar 3 mL de ácido fórmico pura (concentração final de 1%). Adicionar padrão de isótopos estáveis ​​(padrões múltiplos são adicionados se realizar um ensaio multiplex, geralmente essa é cerca de 10 mL contendo 5-10 fmol de peptídeo isotopicamente marcado standard). Lavar a placa do cartucho Oasis bem com 500 mL de 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila 80%, descartando o escoamento. Repita 3 vezes. Equilibrar a placa do cartucho, adicionando 500 mL de 0,1% de ácido fórmico em água, e descartar o escoamento. Repita isso 4 vezes. Carregar amostras digerir a placa do cartucho e ajustar o vácuo de modo que o fluxo é muito lento. Lavar com 500 mL de 0,1% de ácido fórmico em água, e descartar por escoamento. Repita 3 vezes. Peptídeos eluir pela adição de 2 x 500 mL de 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila 80% em 1000 prato fundo bem-mL (não descartam a flow-through). Lyophilize (ou speedvac) o eluído até à dessecação. (Liofilização é o método preferido) Reconstituir secas peptídeos pela adição de 50 mL PBS + 0,03% CHAPS. 2. Peptídeo de enriquecimento de imunoafinidade Transferir a amostra a norma Kingfisher 96 placas bem. Adicionar um anticorpo mg e 1,5 mL da proteína G-esferas magnéticas revestidas por alvo (que é opcional para crosslink o anticorpo para as contas antes disso). Garantir contas são bem suspenso por agitação ou vórtex. Cobrir a placa com papel alumínio. Incubar overnight (12-16 horas) com suave caindo para garantir contas são suspensas. Centrífuga placa a 32 xg por 5 segundos para remover qualquer líquido a partir da superfície da folha. Remova a cobertura de alumínio. Lavagem e eluição das contas pode ser feita manualmente ou de forma automatizada. Este procedimento descreve as etapas automatizadas em uma plataforma de Kingfisher. Lave as contas duas vezes com 200 mL PBS + 0,03% CHAPS (1 minuto por lavagem). Lave as contas uma vez com 200 mL de diluição de 1:10 de PBS + CHAPS 0,03% (1 minuto). Os peptídeos são eluídos em 25 uL de 5% de ácido acético + CHAPS 0,03%. Coloque a placa de eluição em um ímã e transferir o eluato para um prato de 96 poços, tendo o cuidado de não transferir as contas sobra. Cobrir a placa com um tapete de vedação. A placa contendo o eluato é entregue ao espectrômetro de massas triplo quadrapole para análise. 3. Análise por monitoramento de reações múltiplas – espectrometria de massa Transições para SRM / MRM análise podem ser selecionados e otimizados pela infusão de uma solução picomole 1 por microlitro do padrão de peptídeos em 30% de ácido fórmico acetonitrile/0.1% para o espectrômetro de massa de 0,5 mL / min. Uma vez de spray estável é obtido, recolher um espectro de MS / MS. Transições são selecionados a partir do espectro MS / MS, identificando three íons fragmento abundantes em uma região do espectro com pouco ruído. Para multiplicar-íons carregados peptídeo, os fragmentos y-ion detectado em m / z> precursor m / z são normalmente o melhor para o SRM / MRM desenvolvimento ensaio. Figura 2 mostra o espectro de MS / MS e íons de transição selecionados 476,3> 508,3, 579,3 , 692,4 (transições para o pesado isótopo estável padrão não 481,3> 518,3, 589,3, 702,4 mostrado) para a GDSLAYGLR peptídeo. Dependendo da marca e modelo do espectrômetro de massa utilizada, existem vários parâmetros que podem ser otimizados para cada transição. Aqui, nós otimizamos a energia de colisão de cada transição selecionados por ramping a energia da colisão e monitoramento do nível de sinal. A energia de colisão de 25 foi usado para cada transição. Resumidamente, uma configuração típica para SRM / MRM análise é a seguinte: Fase móvel (A) ácido fórmico 0,1%, (B) acetonitrila 90% / 0,1% de ácido fórmico, 0,3 x 5 mm coluna armadilha C18, 75 mM ID x 15 cm coluna analítica C18 (Reprosil-Pur AQ C18, 120 A poros °). O volume de injeção é de 10 mL da amostra e é carregado por 5 min a B 3% a uma vazão total de 3 mL / min e eluída por um gradiente linear 3-45% B no 300-400 nL / min em 10 min. Condições em um QTRAP 4000 (ABSCIEX, Foster City, CA) foram spray de 2,3 kV de tensão, temperatura da fonte de íons de 150 ° C, GS1 de 12, e gás de cortina 15. A amostra é analisada por SRM / MRM, injetando 10 mL da amostra. Áreas dos picos são integrados para peptídeos leves e pesados ​​usando o Skyline programa. 14 Calcule a razão da área de pico (PAR) do peptídeo unlabeled / rotulados em cada amostra usando a transição mais abundante que é livre de ruído de fundo, neste caso, a transição y5 (peptídeo luz 476,3> 579,3, pesado peptídeo padrão 481,3> 589,3). 4. Resultados representativos: Medida razões das áreas de pico (em relação peptídeo luz endógena para peptídeo pesados ​​spiked isotopicamente marcado) fornecer uma medida quantitativa do peptídeo alvo. Figura 3 mostra um exemplo de cromatograma peptídeos leves e pesados ​​em uma amostra SISCAPA enriquecido. Note-se que os peptídeos leves e pesados ​​eluir no mesmo tempo e várias transições podem ser monitorados para cada peptídeo para confirmar a identidade. Figura 1. Panorama Um esquema do processo SISCAPA. Uma mistura de proteínas complexo é digerido em peptídeos. Analitos peptídeo alvo (analito endógenos e uma spiked isótopo estável com etiqueta padrão interno) são enriquecidos com anticorpos anti-peptídeo imobilizada em proteína G-revestido partículas magnéticas. Após isolamento, os peptídeos são alvo eluída as partículas magnéticas e analisados ​​por espectrometria de massa para quantificação em relação ao padrão interno. Figura 2. MS / MS espectro da GDSLAYGLR peptídeo mostrando seleção de três fragmentos de SRM / MRM transições. Figura 3. Cromatogramas Exemplo mostrando o perfil de pico de um analito peptídeo de luz (vermelho) eo pesado isótopo estável com etiqueta padrão interno (azul). Cromatogramas para a transição y5 do peptídeo luz (476,3> 579,3) e de isótopos estáveis ​​pesados ​​rotulados padrão (481,3> 589,3) são plotados ao longo do tempo como eles saem da sistema de cromatografia.