Un enfoque rápido para imágenes de fluorescencia de alta resolución en rodajas de cerebro semi-gruesa

Un objetivo fundamental tanto para la neurociencia básica y clínica es comprender mejor la identidad, estructura molecular, y los patrones de conectividad que son característicos de las neuronas en el cerebro, tanto normales y enfermos. Con este, un gran esfuerzo se ha puesto en la construcción de mapas de alta resolución neuroanatómicas ^1-3. Con la expansión de la genética molecular y los avances en microscopía de luz ha llegado la posibilidad de consultar no sólo morfologías neuronal, sino también la composición molecular y celular de las neuronas individuales y sus redes asociadas ^4. Los principales avances en la capacidad de marcar y manipular las neuronas a través de tecnologías para los transgénicos y de genes en los roedores, ahora permiten a los investigadores a subconjuntos neuronales "programa" a voluntad ^5-6. Sin duda, una de las contribuciones más influyentes de la neurociencia contemporánea ha sido el descubrimiento y la clonación de genes que codifican las proteínas fluorescentes (PM) en los invertebrados marinos ^8.7, junto con sus posteriores de ingeniería para producir una caja de herramientas cada vez mayor de periodistas vitales ^9. La explotación de la célula de tipo específico para impulsar la actividad del promotor dirigido expresión FP en poblaciones neuronales discretos permite ahora la investigación neuroanatómica con precisión genética.

Ingeniería de expresión en las neuronas de FP ha mejorado enormemente nuestra comprensión de la estructura y función del cerebro. Sin embargo, las neuronas individuales de imágenes y sus redes asociadas en los tejidos cerebrales profundos, o en tres dimensiones, sigue siendo un desafío. Debido al alto contenido de lípidos, tejido nervioso, es más bien opaco y de fluorescencia muestra de automóviles. Estas propiedades biofísicas inherentes hacen que sea difícil de visualizar la imagen y las neuronas marcados con fluorescencia de alta resolución mediante microscopía confocal estándar epifluorescencia o más allá de las profundidades de decenas de micras. Para evitar este problema los investigadores suelen emplear serie de secciones delgadas de imágenes y ¹⁰ métodos de reconstrucción, o de 2 fotones microscopía de escaneo láser ^11. Inconvenientes actuales de estos enfoques son los asociados de trabajo intensivo de preparación de tejidos, o la instrumentación un costo prohibitivo, respectivamente.

A continuación, presentamos un método relativamente rápido y sencillo para visualizar las células marcados con fluorescencia en semi fijos de grosor del cerebro del ratón en la limpieza de óptica y de imagen. En el protocolo que se adjunta se describen los métodos de: 1) la fijación de tejido cerebral in situ a través de la perfusión intracardíaca, 2) la disección y remoción de todo el cerebro, 3) incorporación del cerebro estacionario en agarosa, 4) la precisión semi-gruesa rebanada preparación utilizando nuevos instrumentos vibratome de compensación, 5) el tejido cerebral a través de un gradiente de glicerol, y 6) de montaje en portaobjetos de vidrio para microscopía de luz y z-stack de reconstrucción (Figura 1).

Para la preparación de cortes de cerebro se implementó una pieza relativamente nuevo de la instrumentación de la llamada 'Compresstome "VF-200 (http://www.precisionary.com/products_vf200.html). Este instrumento es un microtomo semi-automático equipado con un avance de motor y sistema de vibración hoja de características similares en función a vibratomes otros. A diferencia de otros vibratomes, el tejido a cortar está montado en un enchufe de agarosa dentro de un cilindro de acero inoxidable. El tejido se extruye a espesores que desee en el cilindro, y se corta con la hoja hacia adelante el avance de vibración. El tapón de agarosa / sistema de cilindro permite reproducir el tejido de montaje, alineación y corte de precisión. En nuestras manos, el 'Compresstome "altos rendimientos cortes de tejidos de calidad para electrofisiología, inmunohistoquímica y directa tejido fijado de montaje y de imagen. Combinado con la limpieza de óptica, aquí se demuestra la preparación de los semi-rodajas de cerebro fija de alta resolución de imagen fluorescente.