Makromolekül-ligand Affinity Ölçüm İzotermal Titrasyon Kalorimetre

Izotermal titrasyon kalorimetri (ITC) bir deneyde bağlayıcı bir etkileşim tüm termodinamik parametreler (yakınlık, entalpi ve stokiyometri) belirleyebilirsiniz iyi kurulmuş teknik, izotermal şartlar altında ikinci bir reaktanı bir reaktanı titre 1 ITC çalışır . Ölçülen sinyal iki reaktanları etkileşimi üzerine serbest (bağlama) veya emilen ısı. Bir dizi enjeksiyon yapılır ve ısı sinyali sınırlayıcı reaktanı doygun hale sıfır yaklaşım olacaktır. Izoterm Montaj termodinamik parametreleri verir. Bazı değerlendirmeleri enstrümantasyon yanı sıra veri toplama ve analiz matematik anlatan kullanılabilir. 2,3 diğer kalorimetreleri mevcut olmakla birlikte (en önemlisi küçük hacimleri ile ITC 200), biz burada genel bir protokol VP-ITC için imal tarif MicroCal tarafından (artık GE Healthcare parçası). 1. Hazırlanması Örnekleri Tampon makromolekül ve ligand hazırlamak için, bazı olası sorunları ele alınması gerekir. Doğru uyan makromolekül uygun konsantrasyonları, genellikle örnek ITC hücre ve ligand gider türleri, enjeksiyon şırınga tür gerektirir. Çünkü bazı proteinler enjeksiyon şırınga türler için gerekli olan yüksek konsantrasyonlarda agrega protein, çoğu zaman örnek hücre içine yüklenir. Optimal makromolekül konsantrasyon ITC kullanmadan önce ortogonal yöntemler kullanılarak tahmin edilebilir "c", sistemin tahmin edilen benzeşim ürünü, ve toplam makromolekül konsantrasyonu belirlenir c = K a * [M]. C aralığı 10-1000, 1 Optimal değerler alt sınırının c değerleri ile belirli deneysel koşullar altında zayıf bağlama sistemleri için doğru veri elde etmek mümkün olsa Böylece 4 makromolekül konsantrasyonu bu aralığın ile tespit edilmelidir c akılda değerleri (yani, bir K 10 6 M -1, 10 1000 mcM makromolekül konsantrasyonlarda kullanılması gerekir). Afinitesi sistem hakkında önceden bilgi sahibi ITC deneyi daha iyi bir tasarım ile ITC için kullanılan protein en aza indirmeye yardımcı olabilir. Bu doygunluk titrasyon yarısı ilk üç içinde meydana gelir ligand konsantrasyonu (7-25 kat zayıf ligand bağlanma yeri için K d daha konsantre) kadar büyük olmalıdır. Verileri doğru uydurma da doygunluk sinyali gerektirir. Yüksek afinitesi olan sistemler için, daha düşük bir ligand konsantrasyonu yanlış uyan verecek, çok erken titrasyon doygunluğunu önlemek için kullanılmalıdır. Bir kez seyreltme kontrol ısı (yani tampon içine ligand titrasyon) titrasyon çıkarılır, doygunluk entalpi sıfır yaklaşım gerekir. Küçük molekül kirleri ITC ölçümleri artefakt sinyaller ortaya çıkmasına neden olabilir, çünkü makromolekül ve ligand ince ayrıntısına kadar tampon karşı diyalize olması, mümkünse, en iyisidir. Alternatif olarak, kolon kromatografisi, dönüş sütun tuzsuzlaştırma, ya da tampon değişimi santrifüj filtreleri (örneğin, Centricons) makromolekül tampon değiştirmek için kullanılabilir. Ligand küçük bir molekül ise, makromolekül küçük moleküller için uygun (yani 100-500 Da Spectra / Por Float-A-Lyzer kesilecek Diyaliz membranları karşı diyaliz diyaliz veya edildikten sonra diyaliz tampon kullanılarak hazırlanmış olabilir .) Ligand ve macromolecule çözümler arasında tampon kompozisyonu farklılıklar örneklerde safsızlıkların seyreltme ısı eserler sinyal yol açabilir. Hazırlandıktan sonra, entalpi gölgeleri, tampon, makromolekül ve ligand maç pH (± 0.05 pH birimi) tampon protonasyon etkileri nedeniyle ortaya çıkabilir emin olmak için kontrol edin. 5 her tür yeterince hazırlamak için emin olun . Üç nüsha deney ve seyreltme kontrolü için gerekli malzeme miktarı, kullanılan ITC bağlıdır. Ancak, yaklaşık 2 ml hacimli numune hücreleri en ITC enstrümanlar için makromolekül çözüm en az 6-7 ml gereklidir olacak ve 15 ml şahin tüpleri uygun hazırlanmış olabilir. 300 mcL enjeksiyon şırınga için, 1-2 ml çözüm yeterli olmalı ve şahin tüpler veya mikrosantrifüj tüpleri ya da hazırlanmış olabilir. Toz ve diğer partiküller, ITC değeri şekilden temel eserler neden olabilir. Bu deney çalıştırmadan önce çıkarılmasını zorunludur. Örnek stok çözümleri ön hazırlıktan sonra, numuneler, 8000 çözüm pelet parçacıklar 14.000 RPM için beş dakika mikrosantrifüj tüpler santrifüj edilmelidir. Süpernatantı pelet rahatsız etmemek için dikkatli olmak ve yeni bir Şahin / mikrosantrifüj tüp içine koyun. Reductants azaltılmış cysteines korumak için gerekli ise, β-Merca düşük konsantrasyonlarda ve taze stokları kullanınptoethanol, TCEP (tris (2-karboksil) fosfin) veya dithiothreitol indirgeyici oksidasyon nedeniyle herhangi bir eser en aza indirmek için. Ayrıca, organik çözücüler (çözünür için metanol veya DMSO gerekebilir bazı küçük molekül ligandlar için ortak) varlığı tampon sinyali eserler neden olabilir. Eğer organik çözücüler ligand için gerekli olan, daha sonra makromolekül çözüm organik çözücü seyreltme sıcaktan kaynaklanan herhangi bir sinyal önlemek için de aynı konsantrasyonu içermelidir. Ligand cosolvents nedeniyle makromolekül arasındaki tampon bileşimi hafif farklılıklar, tuz veya pH örneklerinin hazırlanması sırasında mümkündür. Makromolekül içine örnek tampon veya numune tamponu içine tampon içerik farklılıklardan kaynaklanan ısı sinyalleri sadece kalıntılarından kaynaklanan veri neden olmamasını sağlamak için seyreltme ligand kontrol etmek en iyisidir. Dikkatlice tam konsantrasyonları kayıt sistemine uygun teknikleri (absorbans ölçümleri, HPLC, kolorimetrik testleri, proteinler için BCA testleri, vb gibi) kullanarak makromolekül ve ligand konsantrasyonları kontrol edin. Izoterm sığdırmak için kullanılan gerçek konsantrasyon ve konsantrasyonu farklılıklar stokiyometri, entalpi ve deney belirlenen afinitesi hatalarına neden olur. Bu, özellikle yüksek sıcaklıklarda hava kabarcıkları veya titrasyon sırasında çözünmüş gazları salınımı nedeniyle sinyal eserler, önlemek için gazını örnekleri yaygındır. 2. Deney ayarlama Örnek hücre ve enjeksiyon şırınga makromolekül ve ligand yükleme önce üretici firmanın protokolüne göre temizlenir emin olun. Örnek hücresi, iki veya üç kez 1.8 ml distile su Hamilton şırınga (varil kolayca kırık olarak Hamilton şırınga veya iğne bükük ile dikkatli) kullanarak ile durulayın. Sonraki tampon 1.8 ml örnek hücre birkaç kez yıkayın. Kabarcık oluşumunu önlemek için dikkatli olmak, macromolecule çözüm 1.8 ml örnek hücre yükleyin. Referans hücre saf su ile doldurun. En tamponlar için, distile su referans çözüm olarak kullanmak için iyidir. Ancak, özellikle yüksek iyonik güçlü veya osmolalitesi tamponlar, tampon bir referans olarak kullanmak daha iyidir. Hamilton şırınga yardımıyla referans ve örnek hücreleri hava kabarcıklarını çıkarın. Şırınga, iğne, hücrenin altındaki ve hücrenin en iyi ekli herhangi bir kabarcıkları vurma hücre kenarları yukarı ve aşağı yavaşça hareket. Örnek ve referans hücreler herhangi bir aşırı ses çıkarın. Plastik bir enjektör boru kullanarak enjeksiyon şırınga doldurma bağlantı noktasına takın. Enjeksiyon şırınga saf su ile durulayın. Durulama tarafından bir tampon uygulayın. Enjeksiyon şırınga sistemi aracılığıyla hava çekerek tamamen boşaltılmış olduğundan emin olun. Tüm şırınga dolana kadar ligand çözüm içine enjeksiyon şırınga iğnesi enjeksiyon enjektör içine yerleştirin ve ligand çözümü çizmek. Liman ve ekli boru içine biraz fazla hacmi (yaklaşık 50 ul veya daha fazla) çizmeye devam. Hemen şırınga doldurma portu kapatmak ve boru ve plastik şırınga ayırmak. Şırınga herhangi bir kabarcıkları kaldırmak için Temizle ve dolum enjeksiyon şırınga iki kez daha. Ligand çözüm şırınga çıkarın ve bu şırınga ses çıkarabilir kimwipe şırınga ucu dokunmamaya dikkat ederek, kimwipe herhangi bir damla kaldırmak için bir yan silin. Ayrıca, bu da şırınga ucu hacim kaybına neden olabilir şırınga vurmayın veya kavanoza dikkatli olun. Örnek hücre içine enjeksiyon şırınga yerleştirin. ITC çalıştırmak için parametreleri ayarlayın. Güçlü ısı sinyalleri ile bağlayıcı sistemler için, düşük hacimli enjeksiyonlar çok sayıda montaj için daha fazla veri noktaları (örneğin 3 ul 75 enjeksiyon) verecektir. Zayıf ısı sinyallerini sahip sistemler için, az sayıda büyük hacimli enjeksiyonlar (8 ul örneğin 33 enjeksiyon) tercih. En sık olarak, yüksek enjeksiyon hacimleri ile daha az enjeksiyonlar kullanılır. Bu sizin sisteminiz için en iyi koşulları optimize etmek için birkaç titrasyonları sürebilir. Bağlayıcı entalpi çalışılan sisteme bağlı olarak, ekzotermik yada endotermik olduğunu not etmek önemlidir. Ne yazık ki, bazı sistemler, ısı tepki belirlemek zor hale, düşük ısı sinyalleri var. Potansiyel olarak bu tür sistemleri ile ilgili problemler, makromolekül konsantrasyonu artırarak, değişen sıcaklık deneyi (bağlama sistemi ısı kapasitesine bağlı olarak), ve / veya pH değerini değiştirerek veya tamponun iyonik gücü tarafından aşılabilir. Ayrıca her enjeksiyon arasındaki zaman aralığı göz önünde bulundurun. Ligand, her enjeksiyondan sonra, sistem denge sağlaması için süre verilir şarttır ve sonraki enjeksiyon meydana gelmeden önce ısı sinyali başlangıca döner. Çoğu sistemde, 3-5 minutes yeterli olmalıdır. Enjeksiyonlar arasındaki süre, dengeleme beş dakika içinde oluşmaz sistemleri için artırılması gerekmektedir. Örnek hücre içine eklenir kez enjeksiyon şırınga makromolekül ve ligand çözümleri arasında biraz da karışıklık olacağı için, ilk enjeksiyon sahte sonuçlar verecektir. Bu ilk bir veya iki enjeksiyon (bu yüzden daha sonra iptal edilebilir) için küçük hacimli (örneğin 2 ul) ve istediğiniz değerleri sonraki enjeksiyonlar tutmak en iyisidir. Deney sıcaklığı (25 ° C arasındaki sıcaklıklarda 2 ile 80 ° C kullanılabilmesine rağmen, en yaygın olarak). Seçin Ligand makromolekül sistemi üzerinde yapılan diğer deneylerin (bağlama, kinetiği, vb.) Eşleşen bir sıcaklık seçmek için en iyisidir. ITC deney sıcaklığı farklı bir sıcaklıkta dengeye kurulabilir. Deney fazla 10 ° C uzakta oda sıcaklığında bir sıcaklıkta olacak ise, o zaman 5 ° C deneysel sıcaklık içinde araç dengeleme sıcaklığını ayarlamak için iyi. Bu cihaz deney sıcaklığına ulaşmak için alacaktır zaman azalacaktır. Şırınga karıştırma hızı da göz önüne alınması gerekiyor. Karıştırma titrasyon sırasında ligand ve makromolekül yeterli karıştırma için gerekli, ancak bazı proteinler hızlı karıştırarak istikrarsızlaştırdı. Bu gibi durumlar için, karıştırma hızı nispeten düşük bir oranda ayarlanmış olmalıdır. Bir kez tüm deneysel parametreleri, daha sonra deney başlamış olabilir kurmak olmuştur. Deney bittikten sonra, ITC, üretici firmanın protokolüne göre temizlenir. Makromolekül-ligand kompleks karışımı ilave deneyler istendiğinde, deney sonunda örnek hücre çözüm tutulabilir. Titrasyonları tekrarlanabilir verileri almak için en az bir ya da iki kez daha tekrarlayın. Ligand ligand için seyreltme ısı belirlemek için örnek hücre içine tampon titre edilir bir kontrol çalıştırın. Bazı sistemler için bağlayıcı süreci hakkında kooperatif bağlama, ek bilgi yoktur makromolekül ligand içine enjekte edilerek elde edilebilir. Farklı enjeksiyon yönelimleri küresel montaj için yararlı olabilir ek bilgi verebilir. 6 3. Veri analizi Veri Montaj kolayca herhangi bir veri montaj programı (genellikle cihaz ile birlikte üretici tarafından sağlanan) makrolar kullanılarak yapılabilir. Ilk veri dosyası yükleyin. Herhangi bir işaret sinyal hava kabarcıkları veya diğer eserler için ham değeri şekilden kontrol edin. (O zaman noktasında herhangi bir enjeksiyon vardı temel ya da zirveleri ani gibi) herhangi bir eser varsa, bunlar kaldırılacak olması gerektiği gibi, daha sonra bu veri noktalara dikkat. Sonra, ligand seyreltme kontrol verileri yük ve ligand bağlayıcı izoterm seyreltme veri çıkarma. Şu anda, seyreltme eserler meydana gelen titrasyon ilk bir veya iki veri noktası (7. adıma bakınız) dahil olmak üzere, tüm sahte veri noktaları çıkarın. Verilerin sığması amacıyla kullanılmak üzere veri uydurma modeli (bir bağlanma yeri, iki / çoklu bağlayıcı siteleri, kooperatif bağlama, vb.) Seçin. Verileri (K), uydurma parametreleri, stokiyometri (n), entalpi (ΔH) ve bağlanma afinitesi ilk tahmin uygun olabilir . Afinitesi veya diğer parametreler önceden bilgi, dik deneyler bilinen ise, bu değerler girilebilir. Bu uydurma sırasında yerel minimum sıkışıp haline uyum uzak durmanıza yardımcı olur. Veri ilk titrasyon için uygun edildikten sonra, geri kalanı için izotermleri 15 ve 16. adımları tekrarlayın. Alternatif olarak, veriler, dünyada bu tür SEDPHAT programları kullanarak uygun olabilir 6 SEDPHAT üçlü karmaşık veri setleri ile birlikte ikili karmaşık veri setleri (yani moleküller A + B) küresel uydurma özellikle yararlı olabilir (moleküller A + B + C) . Örneğin, bir AB karmaşık molekül C bağlayıcı (tam doymuş değilse) A ya da B, C bağlayıcı nedeniyle herhangi bir sinyal olabilir mi her zaman açık değildir. ITC verileri artefakt olduğundan emin olmak için, afinitesi ve ITC elde stoichiometries dik bir yöntem ile karşılaştırıldığında olmalıdır. 7,8 Ayrıca, ITC van't Hoff arsa entalpi entalpi değeri mukayese edilebilir. 9 Ayrıca, artan macromolecule konsantrasyon ile ısı sinyali mutlak değerini artırmak gerektiği gibi ligand veya makromolekül farklı konsantrasyonlarda kullanmak yararlı olabilir. Eserleri, hücre ve şırınga tamponlar uyumlu değilse ortaya çıkması en muhtemel. Eserler için bir başka olasılık saf örnekleri ortaya çıkar. Biz K d ve stoich önceki bilgi yoktur kullanıcı için basit bir ikili karmaşık titrasyonları ile başlamanızı öneririziometry. Daha sonra, eğer ek ligandlar bağlayan, kullanıcı ligand konsantrasyonları farklı, daha karmaşık bir üçlü kompleksi titrasyonları deneyebilirsiniz, ve belki de şırınga ve hücre bileşenleri anahtarlama. Entalpi bir devlet fonksiyonu olarak, hem de yolları için üçlü kompleks oluşum entalpisi bir karşılaştırma katkı olmalıdır. 10, SEDPHAT 6, burada oldukça yararlı muhtemeldir. 4. Temsilcisi Sonuçlar: Şekil 1. E. NADPH kofaktör bağlama için iyi davranmış titrasyon bir temsilci örnek coli kromozom dihidrofolat redüktaz (ecDHFR). Paneli (A), ham değeri şekilden gösterir; (B), entegre değeri şekilden uyum bağlayıcı izoterm Kökeni yazılım bir yerinde modeli kullanarak ve (C) boyunca SEDPHAT izoterm uygun bir bağlayıcı site modeli kullanılarak fit artıklar. Kökeni yazılımı, tek bir site bağlama modelini kullanarak, n = 1.09 ± 0.02, K d = 0.194 ± 0.001 mcM, H = -22,7 ± 0,4 kcal / mol, TΔS = -13.1 ± 0.4 kcal / mol ve işaretiyle karar verilir = – 9.16 ± 0.01 kcal / mol. Sedphat 0.94 n göze kullanarak veri uyar ± 0.01, 0.195, K d ± 0.013 ΔM, bir ΔH -22.5 ± 0.2 kcal / mol, -13,39, TΔS kcal / mol ve -9,15 kcal / mol, işaretiyle karar verilir.