Denne artikel beskriver en<em> In vitro</em> Teknik til overvågning kræftceller invaderer gennem et monolag af endotelceller. Dataene opnået i realtid som en funktion af ændringer i impedans på overfladen af elektroderne ved brønden bund.
Metastatisk udbredelse af maligne celler kræver nedbrydning af basalmembranen, binding af tumorceller til vaskulært endotel, tilbagetrækning af endotheliale vejkryds og endelig invasion og migration af tumorceller gennem endothellaget at komme ind i blodbanen som et transportmiddel til fjerne steder i værten 1-3. Når i kredsløbssygdomme, kræftceller overholde kapillærvæggene og ekstravasere til det omgivende væv til at danne metastatiske tumorer 4,5. De forskellige komponenter i tumorcelle-endotelcelle vekselvirkning kan efterlignes in vitro ved at udfordre et monolag af humane navlevene endotelceller (HUVEC) med kræftceller. Undersøgelser udført med elektron og fasekontrastmikroskopi tyder på, at in vitro-hændelsesforløbet temmelig repræsenterer in vivo metastatisk proces 6.. Her beskriver vi en elektrisk impedans baseret teknik, der overvåger og kvantificerer i real-tid invasion af endotelceller ved maligne tumorceller.
Giaever og Keese først beskrevet en teknik til at måle udsving i impedansen, når en population af celler vokser på overfladen af elektroderne 7,8. Den xCELLigence instrument, fremstillet af Roche udnytter en lignende teknik til at måle ændringer i elektrisk impedans som celler vedhæfte og spredes i en kultur fad dækket med en guld mikroelektrode array, der dækker cirka 80% af det område på bunden af en brønd. Som celler vedhæfte og spredes på elektrodeoverfladen, det fører til en stigning i elektrisk impedans 9-12. Impedansen vises som en dimensionsløs parameter betegnes celle-indekset, som er direkte proportional med det samlede areal af cellekultur godt der er dækket af celler. Derfor kan celle-indekset anvendes til at overvåge celleadhæsion, spredning, morfologi og celledensitet.
Invasionen assay beskrevet i denne artikel er baseret på ændringeri elektrisk impedans ved elektroden / celle interfase, invadere som en population af maligne celler gennem en HUVEC monolag (figur 1). Afbrydelse af endotel vejkryds, tilbagetrækning af endotelmonolaget og udskiftning af tumorceller fører til store ændringer i impedans. Disse ændringer direkte korrelerer med invasive kapacitet af tumorceller, dvs invasion af meget aggressive celler føre til store ændringer i celle impedans og vice versa. Denne teknik giver en dobbelt fordel i forhold til eksisterende metoder til måling invasion, såsom Boyden kammer og Matrigel assays: 1) den endotelcelle-tumorcelle vekselvirkning mere nøje efterligner in vivo-processen, og 2) dataene opnået i real- tid og er lettere kvantificerbar, i modsætning til end-point analyse for andre metoder.
Realtids-HUVEC invasion analysen er en enkel, men effektiv metode til overvågning invasion. Det giver resultater i realtid, hvilket er en betydelig fordel i forhold til andre traditionelle teknikker, der er afhængige af ende-punkt analyse. Assayet kan modificeres til forsøgsmedikamenter, antistoffer, ligander og proteiner som inhibitorer eller stimulatorer af metastaser. Effekten af forskellige agenter på endotel / kræftcellen cross-talk kan vurderes som godt. Ved indførelse af exogene midler, såsom vækstfaktorer og narkotika i dyrkningsmedier, er det vigtigt at sikre, at de ikke påvirker integriteten af HUVEC monolaget. Afbrydelse af HUVEC monolaget kan testes ved at indføre det exogene middel i fravær af invaderende celler, og sikre, at der ikke er nogen ændring i celle indeks. Derfor bør passende kontroller skal indgå som en del af det eksperimentelle design.
Anden celle-linjer demonstrere forskellige celle-indeks kurver, da de udgør en confluent monolag. Formen af kurven, samt den maksimale celle-indeks opnås, er celletype-specifik. HUVEC celler viser et karakteristisk forbigående udfladning af celle indeks 4-6 timer efter podning, efterfulgt af en anden stabilisering på et højere celle indeks efter 16-18 timer. Derfor er det vigtigt at lade cellerne danner et konfluent monolag i mindst 18 timer før tilsætning af tumorceller.
Da cellen indekset er afhængig af den ioniske miljø ved elektroden / celle interfase, forskellige faktorer såsom celle-morfologi og kvaliteten af celle-celle sammenvoksninger påvirke celle-indekset, i tillæg til det dækkede område af godt bund. Derfor må nedgangen i celle-indekset, som forekommer ved tumorcelleinvasion, er en funktion af flere faktorer, som omfatter tilbagetrækning af endotheliale kryds og efterfølgende tumorcelleinvasion.
Den xCELLigence Instrumentet er fremstillet i tre forskellige konfigurationer: realtid celle analysator(RTCA) SP, RTCA MP og RTCA DP. Den RTCA SP instrument indehaver af et 96-brønds E-plade mens RTCA MP instrumentet kan rumme op til seks 96-godt E-plader samtidigt. Dette giver mulighed for high-throughput screening af stoffer og forbindelser. Eksperimenterne i denne artikel er udføres ved hjælp af RTCA DP instrument, som kan holde tre 16-brønds E-plader. Hver E-plade bedrift station kan uafhængigt drives, som tillader flere brugere at køre eksperimenter samtidigt. Den RTCA DP Instrumentet kan også anvendes til at studere migration hjælp CIM-plader. Disse er 16-brønds plader med øvre og nedre kamre adskilt af en polyethylenterephtalat (PET) membran med en gennemsnitlig porestørrelse på 8um. De elektroniske sensorer er placeret på undersiden af den porøse membran af det øvre kammer. Det nedre kammer tjener som et reservoir for kemoattraktant for celler i det øverste kammer. Men en stor fordel af HUVEC invasion assay over CIM-pladerne er, at tumorcelleinvasion i det tidligere is ikke begrænset af porestørrelsen, som endotelcelle invasion afhænger krydstale mellem tumor-og endotelceller.
HUVEC invasion assay kan også udføres på ECIS Z instrument, fremstillet af Applied Biofysik (Troy, NY). Den ECIS Z instrument anvender en teknologi svarende til xCELLigence instrument med forskelle i rækken, og elektroden konfigurationer. Vi har med succes udført HUVEC invasion assays ved hjælp af 8-brønds ECIS arrays. Det er vigtigt at bemærke, at godt bund overfladeareal er større i ECIS arrays, hvilket kræver et større antal af endothelceller og tumorceller til at være belagt: 2.5 x 10 5 og 1 x 10 5 celler hhv.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde var generøst støttet af midler fra Børnecancerfonden (Baltimore, MD), Brandon Carrington Lee Foundation (Silver Spring, MD), DOD (W81XWH-10-1-0137) og NIH (R01CA108641).
Vi vil gerne takke Dr. Anton Wellstein og medlemmer af hans laboratorium for at dele deres erfaringer og hjælpe os med at optimere præsenterede metoder.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
xCELLigence RTCA DP station | Roche | 05469759001 | |
RTCA control unit | Roche | 05454417001 | Notebook with preinstalled RTCA software |
E-Plate 16 | Roche | 05469830001 | |
HUVEC cells | Lonza | CC-2517 | |
EGM-2 media | Lonza | CC-3156 | |
EGM-2 bullet kit | Lonza | CC-4176 | |
0.1% Gelatin in sterile H2O | Millipore | MCPROTO045 |