Un cabello no invasiva técnica de muestreo para obtener ADN de alta calidad de esquiva Pequeños Mamíferos

1. Pelo trampa Antes de la creación de una trampa, una ubicación ideal tiene que ser determinada en el hábitat del pika o talud. Esto incluye montones de heno, que son escondites de vegetación que los animales se acumulan en verano, así como heces dulce que se encuentra en los sitios de letrina. Tiras de cinta de embalaje (10-50cm de longitud) se acumulan para proporcionar una superficie de 360 ​​° pegajoso y se organizan de una manera similar a una red para envolver a la entrada de la pila de heno la pika (Fig. 1), o sitio de la letrina. Dependiendo de la configuración de las rocas, un trozo de hilo de pescar se puede utilizar para apoyar la estructura de la trampa de pelo, pero a menudo no es necesario cuando las entradas son muy pequeñas (<30cm de diámetro), una descripción completa de la utilización de línea de pesca se puede encontrar en Henry y Russello (2010) 3. Trampas de pelo son verificados siempre que sea posible, las muestras de pelo y depositados en la cinta (Fig. 2) se recogen y se etiqueta. Una vez transportados al laboratorio, los pelos se eliminan de la cinta adhesiva con una pinza estéril y se transfirieron a tubos criogénicos y almacenadas a -20 ° C hasta su posterior manipulación. Las muestras de cabello se agrupan a lo largo de un lazo del pelo se considera que pertenecen a una sola persona, mientras que las muestras agrupadas de forma independiente se supone que pertenecen a diferentes personas. En este último caso, el cabello se coloca en tubos diferentes. Estos supuestos más tarde se puede probar por medio de huellas de ADN y los cálculos de la probabilidad de identidad basado en microsatélites datos genotípicos. 2. Extracción de ADN Puesto que el pelo pika es muy delgada y contiene una bombilla de raíz pequeña, hemos demostrado que un mínimo de 25 pelos están obligados a obtener cantidades suficientes de ADN para la buena calidad de amplificación de PCR abajo 3. Se utilizó el sistema IQ ADN (Promega, Madison, WI, EE.UU.) y una versión ligeramente modificada de las instrucciones del fabricante para el aislamiento de ADN de muestras de cabello. En primer lugar, la muestra de cabello se hace girar en una centrífuga de micro-con el fin de evitar la pérdida de cabello, mientras que la apertura del tubo. A continuación, la solución de incubación se prepara mezclando 80 l de solución de incubación con 10μl de la TDT (1M) y 10μl de proteinasa K (18ng/ml) para dar lugar a una concentración final de 0,1 M TDT y 1.8ng/ml de proteinasa K. incubación solución (100 l) se añade a la muestra y se incuba a 56 ° C durante 1 hora. Mientras tanto, la solución de lisis se prepara añadiendo 1 l de DTT (1M) por cada 100 l de tampón de lisis, lo que resulta en una concentración final de 0,01 M de TDT. Solución de lisis preparado (200 l) se añade a la muestra, junto con 7 l de ADN de resina IQ, agitaron durante 3 segundos a alta velocidad y se incuban a temperatura ambiente durante 5 minutos. La muestra se agitaron durante 2 segundos y se inserta en el soporte magnético, donde la separación de partículas magnéticas de la solución se presenta. La solución restante se aspira y se desecha, teniendo cuidado de no molestar a los pellets de resina magnético. La muestra se trata con 100 l de la solución de lisis preparado, vortex y se devuelve al soporte magnético cuando la separación se produce de nuevo. El tampón de lisis que se aspira y se desecha, y este paso se repite tres veces con un tampón de lavado (100 l). La muestra posteriormente se deja secar en el soporte magnético durante 15 minutos. Una vez seco, 100 l de tampón de elución se añade a la muestra y se incuba a 65 ° C durante 5 minutos. La muestra se agita y se inserta en el soporte magnético. La solución que ahora contiene el ADN eluido se transfiere a un tubo Eppendorf de 1,5 ml y almacenadas a -20 ° C hasta más manipulaciones. ADN de muestras de hígado fue extraído utilizando también el sistema de inteligencia del ADN y utilizado como control positivo de amplificación de PCR. 3. Amplificación por PCR El ADN obtenido de nuestro lazo de pelo no invasiva y las muestras de hígado fueron utilizados para amplificar un conjunto de uso común de marcadores moleculares (microsatélites, AFLP, mitocondrial citocromo B y ZFX / ZFY marcador de determinación del sexo). PCR se realizó con un Veriti termociclador (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) en un volumen de 25 l que contiene: 10 – 20 ng de ADN, 0,5 mM de cada primer, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM de MgCl 2, dNTPs 200 mM, a 10 μ de albúmina sérica bovina (BSA; New England Biolabs, Ipswich, MA, EE.UU.) y 0,5 U AmpliTaq DNA polimerasa de oro (Applied Biosystems). Parámetros de los ciclos de los loci microsatélites se han optimizado mediante un programa de ciclos de touchdown (10 min a 95 ° C, 35 ciclos a 95 ° C durante 30 s, 30 s recocido, y 45 s a 72 ° C, seguida de una etapa final a 72 ° C durante 10 min). La temperatura de hibridación redujo en un 1 ° C por cada ciclo de 60 a 55 ° C hasta llegar al sexto ciclo, momento en el que los 29 ciclos restantes continuaron a 55 ° C. Parámetros de los ciclos de los fragmentos mitocondrial fueron descritos como más arriba, pero consistió en 35 ciclos con un recocidotemperatura de 50 ° C. Amplificación de fragmentos polimórficos se llevó a cabo siguiendo el protocolo de los genomas de vertebrados descritos por Bonin 4. Por último, sexado molecular se ha realizado mediante la técnica PCR-RFLP de ZFX / ZFY loci con la digestión de la enzima de restricción HinfI 5. Los productos de PCR de la microsatélites, AFLP y las secuencias del citocromo B se realizaron en un analizador genético ABI 3130xl (Applied Biosystems), mientras digiere ZFX / ZFX fragmentos se llevaron a cabo junto a una escalera de 100 pb (New England Biolabs) en un 3% en gel de agarosa que contiene 2,5% en gel de ADN SYBR seguro. mancha (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) y se visualizan mediante un sistema RED de imagen personal gel (Alpha Innotech, San Leandro, CA, EE.UU.) Microsatélites y AFLPs se visualizaron utilizando GeneMapper v3.7 (Applied Biosystems) y el cromatograma de ADN mitocondrial se visualizan mediante Sequencher v4.7 (Código Gene Corporation, de Ann Harbor, MI, EE.UU.). 4. Los resultados representativos El ADN extraído de muestras de cabello obtenido usando nuestro lazo no invasiva se utiliza para amplificar por PCR de varios tipos de marcadores moleculares. Como base de comparación, utilizando ADN extraído de muestras de hígado se amplificó junto con muestras de nuestro cabello. Nuclear loci microsatélites fueron amplificados con éxito, tanto para el cabello y las muestras de hígado (Fig. 3). A pesar de la intensidad de la señal fue mayor cuando se utilizan las muestras de hígado, esto no tuvo un efecto negativo en la puntuación genotipo (Fig. 3). Resultados similares se obtuvieron cuando se utiliza AFLPs (Fig. 4), secuencias de ADN mitocondrial (Fig. 5), y el marcador ZFX / ZFY sexado molecular (Fig. 6). Figura 1. Un ejemplo de una trampa de pelo no invasiva creado en una pila de heno. Tiras enrolladas de cinta adhesiva transparente se organizan de una manera similar a una red para cerrar la entrada a la pila de heno. Un pedazo de hilo de pesca se utiliza aquí para ofrecer ayuda adicional a la trampa de pelo. Figura 2. Una trampa de pelo éxito que contiene una gran cantidad de pelo pegado a la cinta de embalaje. Figura 3. Un cromatograma representativo de microsatélites nucleares (Ocp6) 8 como se muestra en GeneMapper v3.7 (Applied Biosystems). El cromatograma superior se obtuvo mediante la amplificación de ADN de tejido del hígado, y es heterocigoto (354/358) en este lugar. El cromatograma inferior representa una persona diferente exhibiendo un genotipo heterocigoto (358/362), basado en ADN extraído de pelo. Mientras que la señal del cromatograma de la muestra de cabello tiene una intensidad menor que la muestra de hígado, anotando el genotipo no se ve afectada por esta diferencia en la señal. Figura 4. AFLP un cromatograma representativo (E31T32) como se muestra en GeneMapper v3.7 (Applied Biosystems). El cromatograma superior se obtuvo mediante la amplificación de ADN de tejido del hígado, el cromatograma inferior representa el ADN extraído de pelo. Figura 5. Un representante cromatograma secuencia de ADN mitocondrial (citocromo b) como se muestra en Sequencher v4.7 (Gene Código de Sociedades). El cromatograma superior se obtuvo mediante la amplificación de ADN de tejido del hígado, el cromatograma inferior representa el ADN extraído de pelo. Figura 6. Un marcador representante sexado molecular (ZFX / ZFY) amplificada por el hígado y las muestras de cabello. Este enfoque se basa en la observación de que el cromosoma Y tiene un sitio de restricción HinfI en esta región del cromosoma X no tiene. Por lo tanto, las hembras producen dos migración co-fragmentos de 432 pb, mientras que los machos producen fragmentos de 432 pb, 261 pb y 171.