細胞の成熟せずに樹状細胞の効率的なトランスフェクションに最適化されたプロトコル
Summary
我々は、細胞の成熟を引き起こすことなく、プラスミドDNAやsiRNAのどちらかで初代ヒト単球由来樹状細胞をトランスフェクトの効率的な方法として私たちの最適化されたハイスループットnucleofectionのプロトコルを提示する。我々はさらなる標的遺伝子のmRNAとタンパク質レベルの両方におけるRIG – Iの成功のsiRNAサイレンシングのための証拠を提供する。
Abstract
樹状細胞（DC）は、その開始及び感染1に応答において重要な役割を果たす免疫系の歩哨と見なすことができます。ナイーブなDCによる病原性抗原の検出は、病原体関連分子パターン（PAMPS）と呼ばれる特定の保存構造を認識することができるパターン認識受容体（PRRS）によるものです。 DCによるPAMPsの検出は、成熟樹状細胞への活性化と変革をもたらす細胞内シグナル伝達カスケードをトリガします。このプロセスは通常、他の炎症性サイトカインと一緒に1型インターフェロンの産生によって特徴づけられる、そのようなT細胞との相互作用が適応免疫応答2を開始する所属リンパ節への成熟DCのMHCIIとCD86および移行などの細胞表面マーカーのアップレギュレーション、 3。従って、樹状細胞は自然免疫と獲得免疫系をリンク。
様々な病原体へのDC応答の根底にある分子ネットワークを解明する能力は、これらのシグナル伝達経路の調節とその誘導性遺伝子のより良い理解に重要です。また、感染症や腫瘍に対するDCベースのワクチンの開発を容易に役立つはずです。しかし、研究のこのラインは厳しく、プライマリDCは4をトランスフェクトすることの難しさによって妨害されています。
このようなレンチウイルスシステムなどのウイルスの伝達方法は、、一般的に使用されていますが、このような複雑さやバイオ危険なリスク（関連するコストと）5,6,7,8のような多くの制限を運ぶ。また、ウイルス遺伝子産物の配信は、DC 9,10,11,12を形質導入、それらの免疫原性を増加させる。エレクトロポレーションは、混合結果13,14,15と一緒に使用、しかし、我々はハイスループットトランスフェクションのプロトコルの使用を報告し、決定的にその有用性を実証する最初のですされています。
本報告書では、限られた細胞毒性およびDCの成熟16の不在で、人間の一次樹状細胞のハイスループットトランスフェクションに最適化された商用プロトコルをまとめたものです。トランスフェクション効率（プラスミドGFPの）と細胞の生存率はそれぞれ50％以上、70％であった。定量RT – PCRは、IFNβのない上方制御を実証しないままFACS分析は、トランスフェクションされた細胞の成熟マーカーCD86とMHCIIの発現の増加の有無を設立。このエレクトロポレーションプロトコルを使用して、我々はsiRNAと標的遺伝子RIG – I、mRNAとタンパク質レベルの両方で重要なウイルス認識受容体16,17、ノックダウン効果を持つ樹状細胞の正常なトランスフェクションのための証拠を提供する。
Protocol
Discussion
ナイーブな一次樹状細胞の効率的なトランスフェクションは、ハイスループット解析および自然免疫、獲得免疫の移行を仲介するこの重要な細胞内の細胞の炎症性経路のリバースエンジニアリングのために重要です。しかし、ほとんどの研究者はこれらの細胞は標準的なトランスフェクション技術を使用している場合の両方を効率的かつトランスフェクションの手順を誘導する細胞の成熟せ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
プロジェクトはNIH NIAID契約番号HHSN2662000500021Cによってサポートされていました。我々は彼の技術支援のために明陳に感謝。
Materials
| Equipment/Reagent | Company | Catalogue # | Comments |
|---|---|---|---|
| Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle | Lonza | 108S0109 | Serial number |
| Amaxa Human Monocyte 96-well Nucleofector Kit | Lonza | VHPA-2007 | Contains the Human Monocyte 96-well Nucleofector Solution, the 96-well Supplement and the Nucleocuvettes and plates |
| RIG-I siRNA | Dharmacon | L-012511-00 | |
| GLO siRNA | Dharmacon | D-001600-01-20 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | Supplemented with 10% FCS, 2 mM L-glutamine, 100 U/ml penicillin and 100 μg/ml streptomycin to make DC growth medium |
| DMEM | Invitrogen | 11965 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070063 | |
| Fetal Calf Serum | HyClone | 3070.03 | |
| Dendritic Cells | New York Blood center | DCs are purified from buffy coats using a standard procedure |
References
- Reis e Sousa, C. Activation of dendritic cells: translating innate into adaptive immunity. Curr. Opin. Immunol. 16, 21-25 (2004).
- Bancherau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Clark, G. J. The role of dendritic cells in the innate immune system. Microbes Infect. 2, 257-272 (2000).
- Hamm, A. Efficient transfection method for primary cells. Tissue Eng. 8, 235-245 (2002).
- Henderson, R. A. Human dendritic cells genetically engineered to express high levels of the human epithelial tumor antigen mucin (MUC-1). Cancer Res. 56, 3763-3770 (1996).
- Reeves, M. E. Retroviral transduction of human dendritic cells with a tumor-associated antigen gene. Cancer Res. 56, 5672-5677 (1996).
- Aicher, . Successful retroviral mediated transduction of a reporter gene in human dendritic cells: feasibility of therapy with gene-modified antigen presenting cells. Exp. Hematol. 25, 39-44 (1997).
- Thomas, C. E. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 4, 346-358 (2003).
- Jooss, K. Transduction of dendritic cells by DNA viral vectors directs the immune response to transgene products in muscle fibers. J. Virol. 72, 4212-4223 (1998).
- Mitchell, D. A. RNA-transfected dendritic cells in cancer immunotherapy. J. Clin. Invest. 106, 1065-1069 (2000).
- Mincheff, M. In vivo transfection and/or cross-priming of dendritic cells following DNA and adenoviral immunizations for immunotherapy of cancer-changes in peripheral mononuclear subsets and intracellular IL-4 and IFN-gamma lymphokine profile. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 39, 125-132 (2001).
- Roth, . Helper-dependent adenoviral vectors efficiently express transgenes in human dendritic cells but still stimulate antiviral immune responses. J. Immunol. 169, 4651-4656 (2002).
- Tendeloo, V. F. V. a. n. Highly efficient gene delivery by mRNA electroporation in human hematopoietic cells: superiority to lipofection and passive pulsing of mRNA and to electroporation of plasmid cDNA for tumor antigen loading of dendritic cells. Blood. 98, 49-56 (2001).
- Lenz, P. Nucleoporation of dendritic cells: efficient gene transfer by electroporation into human monocyte-derived dendritic cells. FEBS Lett. 538, 149-154 (2003).
- Prechtel, A. T. Small interfering RNA (siRNA) delivery into monocyte-derived dendritic cells by electroporation. J. Immunol. Methods. 311, 139-152 (2006).
- Bowles, R. Validation of efficient high-throughput plasmid and siRNA transfection of human monocyte-derived dendritic cells without cell maturation. J. Immunol. Methods. , .
- Kato, H. Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response. Immunity. 23, 19-28 (2005).
- Kato, H. Differential roles of MDA5 and RIG-I helicases in the recognition of RNA viruses. Nature. 441, 101-105 (2006).
- Haller, O. The Mx GTPase family of interferon-induced antiviral proteins. Microbes Infect. 9, 1636-1643 (2007).
