توليد خلايا T - Multivirus محددة لمنع / علاج الالتهابات الفيروسية خيفي بعد زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم

1. DC nucleofection حصاد الوحيدات المستمدة من البلدان النامية ، والتي تم الالتزام به المخصب البلاستيك ، ومثقف لمدة 5 أيام باستخدام خلية Genix تستكمل مع وسائل الإعلام IL4 (1000U/ml) ، GMCSF (800IU/ml) ونضجت لمزيد من 24hrs باستخدام السيتوكينات نضوج العاصمة IL4 (1000U / مل) ، GMCSF (800IU/ml) ، IL6100ng/ml ، TNF – α 10ng/ml ، 10ng/ml IL1 – β وPGE2 (1μg/ml) 1 ، عن طريق إعادة تعليق لطيف مع ماصة نقل 3ml. عدد البلدان النامية قادرة على البقاء به التريبان الأزرق ، ونقل إلى أنابيب 3X مع 15ml مما لا يقل عن 6 و 0.5×10 لا يزيد على 6 خلايا 2×10 / أنبوب. الطرد المركزي للبلدان النامية 10mins @ 200G. خلال هذا الوقت قبل وسائل الاعلام الحارة خلية Genix تستكمل مع السيتوكينات نضوج العاصمة (وسائل الإعلام نضوج DC) — 2ml/well في ثلاثة آبار لزراعة الأنسجة 12 يعامل بشكل جيد لوحة في 37 ° / C 5 ٪ CO 2 الحاضنة. بمجرد الانتهاء من الخلايا الغزل ، ونضح وطاف وإضافة البلازميدات الحمض النووي ذات الصلة في كل من الأنابيب في التركيز النهائي من الحمض النووي 5μg / أنبوب. في هذه الحالة إضافة ترميز البلازميد IE1 pp65 – إلى أنبوب رقم 1 ، Hexon – بينتون إلى أنبوب رقم 2 ، وEBNA1 – LMP2 – BZLF1 إلى أنبوب # 3. Resuspend البلدان النامية والحمض النووي مع 100μl حل nucloefection Amaxa ، تخلط جيدا ونقل إلى cuvettes nucleofection. cuvettes مكان في nucleofector 4D ، واختيار البرنامج CB150 (Amaxa / Lonza) ، ثم اضغط على بدء. مزيج مباشرة بعد إضافة nucleofection 500μl 2ml من قبل وسائل الإعلام تحسنت الخلية Genix نضوج العاصمة لكفيت ، بلطف صعودا ونزولا pipetting 2-3 مرات ، ونقل nucleofected البلدان النامية إلى لوحة 12 – المعدة إعدادا جيدا المتبقية التي تحتوي على 1.5 مل من prewarmed وسائل الاعلام العاصمة النضج. نقل إلى 37 لمزيد من 18hrs – 12 C / 5 ٪ CO 2 حاضنة درجة. 2. تي الخلية التحفيز الحصاد وعدد البلدان النامية nucleofected ، وأشرق في 30Gy. يغسل مرة واحدة مع 10ML CTL المتوسطة (45 ٪ RPMI ، الزيارات EHAA 45 ٪ ، 10 ٪ FBS ، 2mm وGlutamax) وresuspend @ 3 × 10 5 مل من البلدان النامية في وسائل الاعلام CTL. تجمع ما لا يقل عن 7.5×10 5 (2.5ml) وبحد أقصى 15×10 5 (5ml) من البلدان النامية التي تحتوي على كل من البلازميدات ونقل البلدان النامية المجمعة للجهاز G – ركس والتي سوف ثم يوضع في الحاضنة. لإعداد الرد إما استخدام خلايا مجمدة PBMCs سابقا أو غير ملتصقة الخلايا وحيدة النواة التي تبقى بعد اختيار العاصمة (التقيد أو التحديد CD14). أذاب الخلايا ، ونقل إلى مستنبت prewarmed ، ويغسل مرة واحدة مع وسائل الاعلام CTL. Resuspend الخلايا في وسائل الإعلام CTL ، عد الخلايا وتقديمهم للتركيز الخلايا 6 2×10 لكل مليلتر. تأخذ 15×10 6 خلايا أو 7.5ml والملحق مع 30000U IL4 (1000U/ml — اضرب النهائي) و300ng IL7 (10ng/ml — اضرب النهائي). نقل 7.5ml من PBMC (15×10 6 خلايا) إلى G – ريكس وأعلى حتى من مفاعل حيوي مع وسائل الاعلام CTL إلى إجمالي حجم 30ml. ثقافة G – ركس ل6-7 أيام في 37 درجة مئوية / 5 ٪ CO 2 حاضنة مرطب. 3. تي خلية التوسع في يوم 07/06 ، 10ML نضح من وسائل الإعلام ، ثم خليط الخلايا في 20ml المتبقية من وسائل الاعلام مع ماصة 10ML والعد باستخدام خلايا قابلة للحياة التريبان الأزرق. إذا كان هناك <50×10 6 تجديد مع وسائل الاعلام الطازج + السيتوكينات. إذا كان هناك> 50×10 6 خلايا إزالة 10ML التعليق الخلية ، ونقل إلى ريكس – G الجديد ، ومن ثم خدمة كل من G – Rexs مع وسائل الاعلام CTL + السيتوكينات الطازجة. الثقافة ل4-6 أيام إضافية. مرة واحدة وقد تم توسيع خلايا كافية ، وأداء الخصائص المظهرية والوظيفية للفائض CTL وcryopreserve لاستخدامها في المستقبل. 4. ممثل النتائج : ويرد التخطيطي لدينا وافقت عليها الهيئة multivirus محددة عملية توليد CTL في الشكل 1. وعلى النقيض من بروتوكولات الاتفاقية CTL multivirus التي تستخدم adenovectors وEBV LCL – الفيروس لتحفيز التفاعل خلايا تي 2 لدينا استبدال المواد المعدية فيروس البلازميدات مع الحمض النووي تكود المستضدات المتعددة المستمدة من كل من الفيروسات 3. لتحفيز trivirus CTL مصممة لدينا ثلاثة multicistronic البلازميدات ترميز Hexon وبينتون واتش ، وIE1 pp65 من CMV ، وEBNA1 ، LMP2 ، وBZLF1 من EBV. وقد تم اختيار هذه المستضدات على أساس نتائج مشجعة السريرية لمنطقتنا والمجموعات الأخرى التي تبين أن الخلايا T – الموجهة ضد أدفانسد hexon وبينتون 2،4-6 ، وCMV – 1E1 وCMV – pp65 وقائية في الجسم الحي 7. لEBV ، EBNA1 هو سائد مناعيا CD4 + T مستضد الخلية المستهدفة التي أعرب عنها في جميع الأورام الخبيثة المرتبطة EBV في الخلايا الطبيعية وباء EBV المصابين 8،9 ، LMP2 يولد مناعة عبر أنواع HLA متعددة ، وأعرب عن معظم الأورام الخبيثة في EBV ، في حين أن 10،11 BZLF1 بترميز آن ، على الفور في وقت مبكر سائد مناعيا مستضد دورة lytic التي تحفز كلا CD4 + CD8 + وخلايا تي من معظم الأفراد والمهم المحتمل للتعاونntrol الخلايا تكرار الفيروس 12. لمزيد من تحسين طرق التصنيع لدينا تعاونا مع تقنية الطبيعة الذي ولدت minimalized ، خالية من المضادات الحيوية (FDA المتوافقة) البلازميدات لتحفيز CTL 13،14. باستخدام هذه الاستراتيجية أن نحقق الكفاءة باستمرار nucleofection من 35 ٪> عالية مع المحافظة على سلامة الخلية (لا تظهر البيانات) 3. الشكل 2 يبين أن تواتر الفيروس الخلايا T محددة ردا على الحمض النووي البلازميدات الأمثل مقاسا ELIspot IFNγ ، كان أكبر من ردا على التعبير البلازميدات pShuttle التقليدية المستندة إلى التعبير عن مستضدات نفس (ن = 8 اتش ، ن = 4 CMV ، و n = 2 EBV). وكان PBMC هامة لتحفيز الخلايا التائية قوية كما هو مبين في الشكل رقم 3 حيث نسبة 01:50 المنتجة دون المستوى الأمثل تفعيل مقارنة 01:20 S : النسبة المثلى من العاصمة R نسبة (ن = 2 المانحين). إنتاج أعداد كافية CTL مع خصوصية المستضد واسع هو شرط مسبق لالفعالية السريرية ضد جميع الفيروسات الثلاثة. ويتحقق ذلك من خلال ثقافة CTL في G – ريكس ، الذي يدعم التوسع متفوقة مقارنة مع الخلايا التائية 24 لوحات جيدة التقليدية (الشكل 4A) 15 ، في حين أن إضافة IL4 وIL7 إلى زيادات الثقافات ذخيرة والنوعية كما هو مبين في الشكل 4B حيث تردد الخلايا التائية المتفاعلة ضد A2 – HLA – CMV pp65 – مشتقة resticted قيمت NLV الببتيد في الثقافات ولدت في وجود أو غياب IL4 و / أو 16،17 IL7. لتقييم قدرة النمط الظاهري والوظيفية للخلايا وسعنا لتحليل تدفق cytometric ، جواني خلوى ELIspot تلطيخ / IFNγ ، وإطلاق سراح 51 المقايسات الكروم على المنتج النهائي لحفظ البرودة / التسريب. عادة الخلايا المولدة والنسائل المتعددة التي يبلغ عدد سكانها خليط من CD4 + و CD8 + الخلايا التائية مع خصوصية مستضد اكتشافها في كل من المقصورات الخلايا التائية. وCTL قادرون على التعبير عن قتل مستضد الفيروسية الخلايا المستهدفة ولكن ليس الفيروس السلبية جزئيا HLA الأهداف المتطابقة ، مشيرا الى انه لا ينبغي لها أن تحفز الطعم ضد المضيف المرض (GvHD) في الجسم الحي (الشكل 5). الشكل 1. rCTL ​​بروتوكول جيل. الأولى ، هي nucleofected البلدان النامية مع البلازميدات مستضد الفيروسية ترميز ثم يخلط مع ذاتي في PBMCs على البحث : S 10 أو 20:01. يتم توسيع الخلايا في G – ركس لمدة 10-14 يوما في وجود IL4 IL7 ، ثم حصادها ، محسوبة ، واختبارها من أجل الهوية والوظيفة والعقم ، وcryopreserved ثم للاستخدام السريري. الشكل 2. البلازميدات الحمض النووي محسن العلوي حمل تفعيل الخلايا التائية في المختبر. وكانت البلدان النامية nucleofected مع محسن وادارة الاغذية والعقاقير المتوافقة Hexon ترميز البلازميدات وبينتون (إيج) ، وIE1 pp65 (CMV) ، وEBNA1 ، LMP2 ، وBZLF1 (EBV) أو البلازميدات pShuttle التقليدية ترميز المستضدات نفسها. وقد استخدمت لتحفيز هذه الخلايا التائية والتي تم تحليل خصوصية ELIspot IFNγ 10 يوما بعد التحفيز. الشكل 3 العاصمة الأمثل : نسب الخلايا التائية لتفعيل CTL. وكانت البلدان النامية في الفترة من 2 nucleofected مع جميع الجهات المانحة البلازميدات three الوجه الأمثل ، واستخدمت بعد ذلك لتحفيز PBMCs ذاتي في 1:20 أو 1:50 العاصمة : نسبة PBMC. وجرى تقييم تواتر تنشيط خلايا تي في يوم 10 من ELIspot IFNγ. الشكل 4. T التوسع في الخلية G – ريكس باستخدام السيتوكينات تعزيز. لوحة ويظهر الجهاز G – ريكس فضلا عن ظهور CTL على الغاز نفاذية الغشاء وتقييمها من خلال الفحص المجهري. ويرد أيضا مقارنة بين الخلية التي تحققت في الانتاج وزراعة الأنسجة لوحات الاتفاقية معاملة مقابل G – ريكس. لوحة باء يبين تواتر CTL مخموس CMV الإيجابية التي تحققت في الثقافات الموسعة في حضور أي خلوى ، IL4 وحده ، وحده ، وIL7 IL4 IL7 +. الشكل 5. النمط الظاهري ووظيفة CTL الموسعة. لوحة ويظهر المثال ممثل النمط الظاهري للCTL multivirus الموسعة ، التي النسائل المتعددة مع خليط من CD4 + (45 ٪ — مساعد) وCD8 + (42 ٪ — السامة للخلايا) تي الخلايا ، والتي غالبية (95 ٪) أعربوا عن ذاكرة علامة CD45RO + / CD62L +. وحة باء تبين أن هذه الخلايا هي محددة لمستضدات جميع تحفيز وpolyfunctional النحو الذي تقدره تلطيخ خلوى الخلايا للكشف عن إنتاج IFNΓ وTNFα بعد التحفيز مستضد جيم لوحة يظهر أن CTL توسيع وظيفية وفقا للقياس بواسطة مقايسة 51 ساعة معتمدة. واستخدمت LCL ذاتي ، إما وحدها أو مع transduced متجه فارغة أو متجه الفيروسة الغدانية معربا عن CMV – pp65 والقطرانيحصل. وجرى تقييم Alloreactivity باستخدام خيفي الانفجارات PHA كهدف.