유동세포계측법에 의해 피해를 입은 척수 조직에서 면역 세포의 양적 평가 : 세포 정제 방법에 대한 소설을 사용

1. 척수 조직의 분리 척수 세그먼트 부상 아닌 부상이나 타박상 척수의 T8 – T10 (T9에서 부상) 스프 라그 돌리 쥐가를 해부하고 실온에서 HBSS에 좋은 가위로 기계 dissociated 있었는처럼 이전 1 설명했다. 조직 분리하기 전에, 전체 척수 컬럼은 코드 세그먼트 T8 – T10의 추출하기 전에 5 분 드라이 아이스에 보관했다. 조직 비트는 원심 분리 (1 분, 1000 RPM, 상온) 및 2.5 MG 트립신 37 20 분 5 ML DME (Dulbecco의 수정된 이글의 미디어) 5 MG의 collagenase ° 분쇄하기 전에 C (와 효소 dissociated에서 검색되었습니다 ~ 10 회 상온에서) 유리 파스퇴르 피펫 (9 인치)와 함께. DME + 10% 태아 소 혈청의 10 ML는 효소 활동을 억제하고 다음 40 μm의 셀 스트레이너를 통해 필터링되었습니다 세포에 추가되었습니다. 빠른 스핀 후, 세포 펠렛은 HBSS 6 ML의 resuspended되었으며 OptiPrep 기울기 솔루션 아래에 설명된에 overlayed. 2. OptiPrep 경사도 솔루션을 만들기 희석 OptiPrep는 걸레의 버퍼 (0.15 M NaCl, 10 MM 걸레, 산도 7.4)와 OptiPrep 1시 1분을 diluting에 의해 건설되었습니다. 푸르 OptiPrep 기울기 솔루션은 혼합 350, 250, 200, 또는 1 ML (표 1)의 최종 볼륨 HBSS 150 μl 희석 OptiPrep에 의해 만들어졌다. 네 가지 솔루션은 천천히 그리고 조심스럽게 바닥에 최소 희석 및 상단 (그림 1A)에서 가장 희석과 15 ML 원뿔 관에 레이어에 배치했다. 3. 세포에서 지질 / myelin 파편을 분리 HBSS에 dissociated 척수 세포 6 ML은 신중하게 OptiPrep 기울기 솔루션의 위에 계층되었습니다. 튜브가 들어있는 셀 및 기울기 솔루션은 지질과 별개의 레이어에 셀 솔루션을 분리, 스윙 – 버킷 로터 (A – 4 – 62)와 함께 Eppendorf의 원심 분리기의 5810R을 사용하여 (15 분, 1900 rpm 또는 726 RCF, 20 ° C) centrifuged되었습니다 / 펠렛에 염증 세포, glia, 그리고 적혈구와 뉴런의 3 레이어, 다음 myelin의 파편 (상단 7 관 ML). monocytes, macrophages, PMN의 granulocytes 및 lymphocytes를 포함한 대부분의 염증 세포, 펠렛에서 발견 되었으나, 일부 대형 – 활성화 macrophages은 펠릿 위의 레이어에서 찾을 수 있습니다. 지질 / myelin 파편 레이어 (상단 7 ML)는 신중하게 aspirated 및 제거되었습니다. 전지는 다음 세탁 및 2.5 ML의 HBSS에 resuspended 아래 immunolabeling 사용되었습니다. 4. 유동세포계측법 특정 면역 세포의 Immunolabeling 척수 준비에서 수집한 전지 (500 μl) pelleted되었으며 적혈구를 lyse 5 분 0.85 %의 암모늄 염화물 (증류수에 희석)에 resuspended. 셀 500 μl HBSS로 씻어 후 실온에서 정상 토끼 또는 마우스 혈청에서 30 분 차단되었습니다. 또는 희석 isotype IgG 솔루션 세포는 1 항체와 시간 (;, 마우스 안티 쥐 ED1 알렉사 488, Serotec 또는 마우스 방지 새앙쥐 인 경우에는 3 번 CD를 알렉사 488 래빗 방지 PMN FITC 정확한 화학 및 과학)에 대한 세탁과 실온에서 incubated되었습니다 HBSS는 (1:100 희석 모든)로 이전 한 설명했다. 세포는 최종 단계 이후에 300 μl HBSS에 resuspended 위에 그리고 각 단계 이후에 두 번 씻어했다. 5. 유동세포계측법에 의해 세포 양적 평가 샘플은 세포 퀘스트 소프트웨어를 사용하여 외과 Calibur (백톤 – 디킨슨) 흐름 cytometer에 분석했다. 샘플 5,000 이벤트는 모두 샘플에 대해 읽고 있었고, 데이터 분석 서밋 (DakoCytomation)에 완성되었다. 흐름 cytometric 게이츠는 이전에 다음 ID로 한 설명된 바와 같이 시간이 지점에 걸쳐 정상화에 대한 기본 값을 설정하는 제어 IgG isotype 표시 셀 또는 손상되지 않은 컨트롤 동물의 척수에있는 세포를 사용하여 설정되었다. 적극적으로 분류 세포의 평균 값은 전체 샘플의 퍼센트 (± SEM)로 표현했다. 6. 대표 결과 : myelin 파편을 제거하고 유동세포계측법에 의해 면역 세포 검출을 향상시키기 위해 OptiPrep 기울기의 기능은 1 척추 PMNs를 quantifying에 의해 평가되었다 DPI (그림 1B), SCI 1-3 이후 PMN의 침투 이전에 보고된 정상. 또는 동일 해부 척추 코드는 myelin 파편 OptiPrep – 제거하지 않고 효소 dissociated되었으며 마찬가지로 유동세포계측법하여 PMN의 침투에 대한 병렬로 평가되었다. 우리가 이전에 하나보고 있으므로, 그대로 myelin의 부스러기와 샘플에서 검색된 PMNs의 비율을 보여주는, 단지 소수 (0.5 %) 혼자 효소 분해에 비해 OptiPrep 기울기 정화 방식과 격리 샘플에서 이벤트의 위치에 변화가 있었어 OptiPrep purif에서 검색된 PMNs의 비율 (5.1 %)의처음엔 샘플 (그림 1B). 이러한 데이터는 조직의 준비에서 myelin 파편이 흐름 cytometric 신호가 불분명한 수있는 제안하고, myelin의 파편의 제거가 부상 척수 조직에서 면역 세포 검출의 감도를 향상 보여줍니다. 부상 척수의 세포 검출을위한 OptiPrep 기울기 시스템의 감도를 설립하는 데, 우리는 2 시간에서 180 DPI에 이르는 기간 동안 세포 침윤의 변화를 특징 및 PMNs, macrophages을 포함 SCI 후 세포 염증의 소설 multiphasic 응답을 설립 / microglia 및 T – 세포. 1-3으로 이전 연구에 의해 확인, PMNs 먼저 2 시간 이후 부상에서 코드를 입력하고 1 DPI를 (그림 2 및 4) 만족. 반면 1,4,5에 Macrophages / microglia는 3 DPI까지 부상 척수에서 발견, 7 DPI (그림 3 및 4)에 처음 만족되지 않았습니다. 놀랍게도, 우리는 macrophages / microglia 두 번째 시간을 60 DPI에 대한 만족을 180 DPI (그림 3 및 4)을 통해 고가 남은 처음으로 표시됩니다. macrophages / microglia, 마찬가지로 T – 세포 침투는 7 DPI 5-7을 최대로 예측했다 있지만, 유동세포계측법는 T – 세포의 높은 번호가 감지되었습니다 불구하고, 첫 번째 7 DPI에서 T – 세포 번호 변경 사항을 감지하지 않았 9 DPI (1.6 %) (그림 4). T – 세포 숫자는 10 DPI, 영구적인 T 세포 반응은 세포의 4.4 %가 인 경우에는 3 번 CD에 들어 (그림 4)로 분류되었던 당시, 180 DPI를 통해 관찰되었다하여 감소하고있는 동안. 함께, 이러한 데이터는 SCI 후 세포의 염증 (그림 4)의 시간 의존 multiphasic 반응을 보여, 세포 염증의 초기 단계는 DPI는 ED1의 피크 + macrophages / microglia 7 DPI와 T에 의해 다음 PMNs 1 초에 최대로 구성되었습니다 – 전지 9 DPI, 나중에 단계 60 DPI에서 macrophages / microglia의 주목할만한 초 피크와 14 DPI 후 상승 180 DPI를 통해 저항을 세 세포 인구의 구성 동안. 이 timecourse 연구 및 유동세포계측법에 의해 생성되는 양적 데이터는 immunolabeled 척수 섹션 1 양적 stereology에서 수집된 데이터 비교 결과를 보여주는, 이전에 검증되었습니다. 표 1. myelin의 파편의 제거를위한 OptiPrep 기울기의 작성. 네 OptiPrep 기울기 솔루션은 HBSS와 희석 OptiPrep (OptiPrep와 걸레의 1시 1분 희석)을 사용하여 만들어집니다. 그림 1. OptiPrep 기울기 밀도 별도의 대부분의 myelin / 부상 척수 조직 / 세포에서 파편과 유동세포계측법에 의해 면역 세포 평가를 향상시킵니다. (A) Myelin / 파편은 myelin / 파편 계층의 열망 다음 OptiPrep 기울기를 통해 dissociated 척수 조직의 원심 분리 후 세포 (뉴런, glia 및 면역 세포)에서 분리되었다. 부상 척수에서 (B) PMN 번호, 파편 제거 후 PMNs를 감지 증가 감도 (학생의 T – 테스트, P는 = 0.0001)를 보여주는. n은 그룹당 = 5, ± SEM을 의미, 모든 흐름 cytometric 게이츠는 손상되지 않은 동물의 분류 세포를 사용하여 설정되었다. 샘플 5,000 이벤트는 모두 샘플에 대한 읽을 수 있었고, 긍정적으로 표시된 세포의 평균 값은 전체 샘플의 퍼센트 (± SEM)로 표현했다. 그림 2. 유동세포계측법으로 부상 척수에 PMN 침투 감지. T9에서 중간 (200 KD) 타박상 부상 후, PMNs 신속하게 2 시간 (B) 후 부상을 시작하고 1 DPI (C)를 peaking 척수를 입력했습니다. 모든 흐름 cytometric 게이츠는 손상되지 않은 동물에서 표시된 세포를 (A)를 사용하여 설정되었다. 그림 3. macrophages / 유동세포계측법으로 부상 척수에서 microglia의 침투 감지. T9에서 중간 (200 KD) 타박상 부상 후 ED1 + 대식 세포 / microglial 번호 3 DPI (D)에서 시작 부상 척수 증가 7 DPI (E)에서 심하게 만족, 14 DPI (F)에서 낮은 수준으로 떨어졌다 전에는 60 DPI (G)에 두 번째 피크로 상승하고, 최대 180 DPI (H)로 부상 척수에 남아. 7 DPI 척수 세포의 IgG isotype 관리 라벨 (B)는 최소한의 항체 – 라벨 배경과 2 시간에서 항체 – 레이블 셀이 후 부상 (C) 또는 손상되지 않은 (A) 동물 어떠한 차이가 없음을 보여 줬다. 모든 흐름 cytometric 게이츠는 손상되지 않은 동물의 분류 세포를 사용하여 설정되었다. 표 2. timecourse 실험에서 동물 샘플. 각 시점 (0 HR 180 DPI)의 경우, 다섯 동물, T9에서 중간 (200 KD) 타박상의 상처를 받았습니다및 척수 조직이 PMNs, ED1 + macrophages / microglia, 그리고 인 경우에는 3 번 CD + T – 세포의 숫자 유동세포계측법에 의해 평가되었다. 그러나, 모든 동물의 샘플 PMN (4-5), ED1 (3-5), 그리고 인 경우에는 3 번 CD (4-5) 흐름 cytometric 분석을 성공적으로 복구되었습니다. 그림 4. T9에서 중간 (200 KD) 타박상 부상 다음과 척수에 염증 세포의 timecourse. 으로 유동세포계측법, PMNs의 숫자, ED1 + macrophages / microglia, 그리고 인 경우에는 3 번 CD에 의해 평가 + T – 세포가 심하게 만족 (각각 1,7, 9 DPI) 및 부상 척수에서 만성 지속. n은 = 3-5 회 그룹, ± SEM을 뜻합니다.