Uso de fluorescentes Imuno-Química para a detecção de Edwardsiella ictaluri Em bagre do canal ( I. punctatus) Amostras
Summary
Aqui nós descrevemos um procedimento que permita a rotulagem de<em> Edwardsiella ictaluri in situ</em> Em cortes histológicos de bagre do canal<em> Ictalurus punctatus</em> Usando imunohistoquímica indireta com anticorpos monoclonais Ed9 como primária, e fluorescente FITC anticorpos rotulado como um secundário. Isso permitiu a detecção da bactéria por microscopia de fluorescência.
Abstract
Enquanto Edwardsiella ictaluri é um importante patógeno do canal catfish Ictalurus punctatus e foi descoberto há quase três décadas 1,2, até agora, a melhor do conhecimento desses autores, nenhum método foi desenvolvido para permitir a visualização em situ do bactérias em cortes histológicos.
Enquanto a localização bacteriana foi determinada in vivo em estudos anteriores usando contagem placa 3, 4 radiométrica rotulados ou bactérias bioluminescentes 5, a maioria destes estudos só foram realizados ao nível de órgãos bruto, com uma exceção 6. Esta limitação é particularmente preocupante porque E. ictaluri tem um complexo ciclo de infecção 1,7, e tem uma variedade de fatores de virulência 8,9. A complexa interação de E. ictaluri com a sua variedade é semelhante em muitos aspectos, a Salmonella typhi 10, que está na mesma família taxonômica.
Aqui nós descrevemos uma técnica que permite a detecção de bactérias usando indireta imuno-histoquímica, usando o anticorpo monoclonal Ed9 descrita por Ainsworth et al. 11.
Resumidamente, um soro de bloqueio é aplicada a inclusão em parafina os cortes histológicos para prevenir não-específicas de licitação. Então, as seções são incubadas com o anticorpo primário: E. ictaluri anticorpo monoclonal específico Ed9. Anticorpos em excesso são lavados afastado eo FITC anticorpos secundários são adicionados. Após a lavagem, as seções são montadas com um meio específico fluorescentes de montagem.
Isso permitiu a detecção de E. ictaluri in situ em cortes histológicos de tecidos bagre do canal.
Protocol
Discussion
Este protocolo de detalhes de uma técnica para a visualização em situ do bagre patógeno Edwardsiella ictaluri em cortes histológicos. O melhor de nosso conhecimento, este é o primeiro protocolo, tais descrito.
O passo mais crítico, em nossa experiência, é a lavagem dos anticorpos, tal como descrito no passo 4.4 do presente protocolo como a lavagem insuficiente pode resultar em falso positivo.
O principal problema com interpretação dos…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores desejam reconhecer a assistência técnica da Banes Michelle, assim como Dr. Petrie-Hanson Eels, Dr. Timothy Brown e por sua assistência em desenvolvimento e realização da imuno-histoquímica. Este projeto foi financiado pelo USDA CRIS projeto # MISV-0801310 e pela Mississippi State University College of Veterinary Medicine.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Brain Infusion broth | Becton Dickinson | 237200 |
| MS222 | Argent Labs | |
| Whole mouse Serum | Cappel | 55989 |
| Goat anti-mouse FitC | Southern Biotech | 1010-04 |
| Permafluor | Lab Vision | Ta-030-FM |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P-4504 |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100-6X500ML |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | 85040C |
| Potassium phosphate (KH2PO4) | Sigma | P-5379 |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S-5761 |
| Sodium chloride (NaCal) | Sigma | S-9625 |
| Sodium phosphate dibasic(Na2HPO4) | Sigma | S-9390 |
References
- Plumb, J. A., Woo, P. T. K., Bruno, D. W. . Fish Diseases and Disorders. , 479-479 (1998).
- Roberts, R. J. . Fish Pathology. , (2001).
- Lawrence, M. L. . Louisiana State University. , (1997).
- Nusbaum, K. E., Morrisson, E. E. Entry of 35S-Labeled Edwardsiella ictaluri into Channel Catfish. Journal of Aquatic Animal Health. 8, 146-146 (1996).
- Karsi, A., Menanteau-Ledouble, S., Lawrence, M. L. Development of bioluminescent Edwardsiella ictaluri for noninvasive disease monitoring. FEMS Microbiology Letters. 260, 286-286 (2006).
- Miyazaki, T., Plumb, J. A. Histopathology of Edwardsiella ictaluri in channel catfish, Ictalurus punctatus (Rafinesque). Journal of Fish Diseases. 8, 839-839 (1985).
- Areechon, N., Plumb, J. A. Pathogenesis of Edwardsiella ictaluri in Channel Catfish, Ictalurus punctatus. Journal of the World Mariculture Society. 14, 249-249 (1983).
- Dumpala, P. R., Lawrence, M. L., Karsi, A. Proteome analysis of Edwardsiella ictaluri. Proteomics. 9, 1353-1353 (2009).
- Thune, R. L. Signature-Tagged Mutagenesis of Edwardsiella ictaluri Identifies Virulence-Related Genes, Including a Salmonella Pathogenicity Island 2 Class of Type III Secretion Systems. Applied and Environmental Microbiology. 73, 7934-7934 (2007).
- Karsi, A. High-throughput bioluminescence mutant screening strategy for identification of bacterial virulence genes. Applied and Environmental Microbiology. 75, 2166-2166 (2009).
- Hook, E. W., Mandell, G. L., Douglas, G., Bennett, J. E. . Principles and Practices of Infectious Diseases. , 1700-1700 (1990).
- Ainsworth, J., Capley, G., Waterstreet, P., Munson, D. Use of monoclonal antibodies in the indirect fluorescent antibody technique (IFA) for the diagnosis of Edwardsiella ictaluri. Journal of Fish Diseases. 9, 439-439 (1986).
