Генерация Композитный Растения в Medicago прудовик Используется для нодуляции Анализы

Следующий протокол был использован для создания волосатый корень композитных растений в модели бобовых видов M. прудовик. Аналогичные протоколы были адаптированы для по меньшей мере восемь видов растений 1-4. Мы использовали М. прудовик волосатый корень композитных растений для изучения функций генов в корень и узелок развития. Протокол был разделен на четыре раздела: 1) подготовка растительных материалов, 2) генерации волосатый корень композитных растений, 3) симбиотических инфекции ризобии и 4) трансгенных корневой идентификации. Мы использовали двоичный вектор, содержащий зеленый флуоресцентный белок (GFP) гена в качестве репортера для скрининга трансгенных корень в композитных растений 3. По сравнению с антибиотиками основе отбора, GFP-скрининг это просто, быстро и недорого. В нашей конструкции, ЭР-выражение оптимизированный ген GFP управляется супер убиквитин промоутер, который имеет сильного конститутивного сигналы GFP у трансгенных корней, что позволяет легко различия между трансгенной и не-трансгенных корней. 1. Подготовка материалов завод М. truncautla семена собирают с растений, выращенных в теплице (50% относительной влажности, 16 / 8 ч свет / тьма, 22/18 ° C день / ночь температура). Зрелые семена могут храниться при температуре 4 ° C. Около 100 Семена раскритиковали в 10 мл концентрированной серной кислоты (95-98%, Sigma-Aldrich, МО) в течение 10 мин при периодическом встряхивании. Семена промывают 5-7 раза стерильной водой с мягким агитации. Семена затем замачивают в воде при комнатной температуре в течение 6 часов и хранить при температуре 4 ° С в течение 36-48 часов, чтобы синхронизировать прорастания. Примерно 20-30 семена распространяются на влажной фильтровальной бумаги помещают в чашку Петри. Они ведутся при 22 ° С, с 16 / 8 ч свет / темно-цикла, и 40 μmol.m -2. С -1 интенсивность света, в течение 5-6 дней. Проросшие саженцы переносят в почву и помещают в теплицы для месяц. 2. Генерация Волосатый Корневая Композитный Растения Двоичные конструкций проведения гены интереса были преобразованы в А. rhizogenes с помощью стандартных протоколов. У нас разработан набор бинарных векторов, содержащих ген GFP в качестве маркера, которые облегчают отбор трансгенных тканях. Эти векторы содержат различные промоутеры и все они имеют шлюз клонирования сайтов (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния), более-выражение или глушителей целевых генов 3,5. А. rhizogenes культивируют в 50 мл LB среды с соответствующим антибиотиком выбора при 28 ° С в течение 16-24 часов. Бактерии собираются и вновь приостановлено до конечной концентрации OD 600 = 0,3 в безазотистые решение питательных веществ для растений (табл. 1 и 6). Для поддержки волосатые регенерация корня, стерилизовать поддержки матрицы ("Минеральная вата", Hummert International, Земля City, MO) разрезается на пробки примерно 3 см 3. Мы размещаем 4 разъемами в одну чашку Петри. Отверстие тыкали друг на плагин с помощью пипетки наконечник для облегчения вставки эксплантов. A. rhizogenes (5 мл) добавляют в каждую пробку. Стрелять раздел с 2-3 пазушных почек иссекается по косой разрез. Эксплантов затем вставляется в разъем, и, выращенных при 22 ° С в течение примерно трех недель. Мы продолжаем Medicago эксплантов без полива в течение первых 10 дней, затем, поливать их по 5 мл безазотистые решение в случае необходимости. Мы обнаружили, что удаление апикальной меристемы может уменьшить образование придаточных корней. 3. Симбиотические ризобии (Sinorhizobium Meliloti) Инфекция После трех недель, некоторые придаточные корни выйдет из минеральной ваты. Волосатый корень композитных растений передаются песка или вермикулита (стерилизованные), с или без минеральной ваты. Они выращены в теплице при 22 ° С, 16 / 8 ч свет / темно-цикла, и 300 μmol.m -2. С -1 интенсивности света на еще одну неделю. До ризобии инфекции, С. meliloti 1201 выращиваются в 50 мл экстракта дрожжей-маннита среду в течение 7 дней при 30 ° С (табл. 2 и 6,7). Повторно приостановлены ризобии клетки разбавляют до конечной концентрации OD 600 = 0,08 с использованием азота бесплатное решение питания. 10-мл свежего приостановлении С. meliloti был применен к каждой составной растение, чтобы вызвать образование узелков. 4. Трансгенные Идентификация корневых Через две недели после прививки ризобии, композитный растения до укоренившиеся промывкой в ​​воде. Корни можно легко отделить от песка или перлита в воде. Мы размещаем волосатые корни под УФ-микроскоп (Nikon SMZ1500, Возбуждение 460-500 нм, дихроичным 505nm, Барьер более 510nm). Трансгенные корни GFP положительные и придаточные корни GFP отрицательным. Затем мы собираем корни Accordinг сигнал GFP, и рассчитывать узелок чисел, мера длины корня, и вычислить плотность боковых корней. GFP отрицательных корней используют в качестве контроля. 5. Представитель Результат В нашем эксперименте новые корни волос восстанавливается из эксплантов в течение 2-3 недель после А. rhizogenes прививок. Под ультрафиолетовым микроскопом, трансгенные корни несущих ген GFP показывают уверенный зеленая флуоресценция (рис. 1). Количество регенерировать корни и часть GFP положительных корней зависит от условий эксплантов и роста среды составную среднюю plants.On, 25% корней производится были трансгенных волосатые корни 3. Для повышения эффективности трансформации, 1) пластиковая крышка обреченности, как показано на видео, достаточно для поддержания влажности в росте лоток в течение первых нескольких дней, и растения требуют лишь немного воды в первые несколько дней. Чрезмерный полив ущерб волосатые корнеобразования, 2) концентрация Agrobacterium innoculant важна для трансформации. Чрезмерное количество клеток не полезно волосатой формирование корня или образование узелков. Для образование узелков, поливной воды должна быть безазотистые, в противном случае будет несколько узелков форме. Волосатый корень композитных растения могут быть созданы с помощью семядоли или entact рассады в качестве исходного материала. Лишь незначительные модификации выше протокола ncessary генерировать волосатые корни из других тканей 8. Важно отметить, что каждый волосатый корень независимое событие трансформации. Таким образом, фенотип наблюдается в один композитный завода суммы нескольких событий transforamtion, которые должны быть подтверждены в нескольких повторений композитных растений Рисунок 1. А. Трансгенные корни могут быть отсортированы от волосатых корней. B. Узлы были сформированы в волосатый корень композитных растений. Мы, расположенный на 4-недельных М. прудовик волосатый корень растения под УФ-микроскоп и GFP положительных корней могут быть легко идентифицированы. (Красная стрела: GFP корень; Желтая стрела: не GFP корень) Акции g/200ml мл акции / литр MgSO 4 .7 H 2 O 12,3 2 CaCl 2 · 2H 2 O 14,7 4 K 2 HPO 4 0,3 H 2 O 6,8 1 K 2 SO 4 11 4 Fe Cl 3 0,6 H 2 O 0,49 2,5 Микроэлементы См. ниже 1 Микроэлементы г на литр H 3 BO 3 0,142 MnSO 4. H 2 O 0,077 ZnSO 4 .7 H 2 O 0,1725 CuSO 4 .5 H 2 O 0,037 NaMoO 4. H 2 O 0,024 CoCl 2. H 2 O 0,0025 NiSO 4 0,001 Таблица 1. Nitogen без питания решение K 2 HPO 4 0,5 г NaCl 0,1 г MgSO 4 · 7H 2 O 0.2g Дрожжевой экстракт 0,4 г Маннитол 10g рН = 6,8 Таблица 2. Дрожжевой экстракт маннитол среды (на литр)