Generierung von Composite-Anlagen in Medicago truncatula Für Nodulation Assays verwendet

Das folgende Protokoll wurde verwendet, um hairy root Composite-Anlagen erzeugen in einem Modell Leguminosenarten M. truncatula. Ähnliche Protokolle für mindestens acht Pflanzenarten 1-4 angepasst. Wir benutzten M. truncatula hairy root Composite Pflanzen zu studieren Genfunktionen in Wurzel und Knötchen Entwicklung. Das Protokoll wurde in vier Abschnitte unterteilt: 1) Vorbereitung pflanzlichen Materialien, 2) erzeugt hairy root Korbblütler, 3) symbiontischen Rhizobien Infektion und 4) transgenen Wurzel Identifikation. Wir verwendeten den binären Vektor mit dem grün fluoreszierenden Protein (GFP)-Gen als Reporter für das Screening von transgenen Wurzel in Composite-Pflanzen 3. Im Vergleich zu Antibiotika-Selektion ist GFP-basierte Screening schnell, einfach und kostengünstig. In unserem konstruieren, ist die ER-Ausdruck-optimierte GFP-Gen durch die Super-Ubiquitin-Promotor, die starken konstitutiven GFP-Signale in transgenen Wurzeln getrieben hat, was eine einfache Unterscheidung zwischen transgenen und nicht transgenen Wurzeln. 1. Vorbereitung Werk Materials M. truncautla Samen von Pflanzen in einem Gewächshaus (50% relative Luftfeuchtigkeit, 16 / 8 h hell / dunkel, 22/18 ° C Tag / Nacht-Temperatur) geerntet. Reife Samen können bei 4 ° C gelagert werden Etwa 100 Samen werden in 10 ml konzentrierter Schwefelsäure (95-98%, Sigma-Aldrich, MO) für 10 min mit periodischen Schütteln scarified. Die Samen sind 5-7 mal mit sterilem Wasser unter leichtem Rühren gespült. Die Samen werden dann in Wasser bei Raumtemperatur getränkt für 6 Stunden und bei 4 ° C für 36-48 Stunden, um die Keimung zu synchronisieren. Ca. 20-30 Samen werden auf feuchtem Filterpapier Papiere in einer Petrischale ausgebreitet. Sie sind bei 22 ° C gehalten, mit 16 / 8 h Licht / Dunkel-Zyklus und 40 μmol.m -2. S -1 Lichtintensität, für 5-6 Tage. Gekeimten Sämlinge werden in den Boden überführt und im Gewächshaus für einen Monat. 2. Generieren von Hairy Root-Composite-Pflanzen Binary Konstrukte tragen Gene von Interesse wurden in A. verwandelt rhizogenes über Standardprotokolle. Wir haben eine Reihe von binären Vektoren, die das GFP-Gen als Marker, dass das Screening der transgenen Gewebe erleichtern entwickelt. Diese Vektoren enthalten verschiedene Promotoren und haben alle Gateways Klonierungsstellen (Invitrogen, Carlsbad, CA) für die Überexpression oder Inaktivierung von Genen gezielt 3,5. A. rhizogenes ist in 50ml LB-Medium mit entsprechenden Antibiotika-Selektion bei 28 ° C für 16-24 Stunden kultiviert. Die Bakterien werden gesammelt und zu einer endgültigen Konzentration von OD 600 resuspendiert = 0,3 in einer Stickstoff-freie Pflanze Nährlösung (Tabelle 1 und 6). Zur Unterstützung hairy root Regeneration, eine sterilisierte Trägermatrix ("Rock Wolle", Hummert International, Earth City, MO) in Stecker von ca. 3 cm 3 geschnitten. Wir legen 4 Stecker in eine Petrischale. Ein Loch wird oben auf jeder Stecker mit einer Pipettenspitze stieß auf das Einfügen von Explantaten zu erleichtern. A. rhizogenes (5 ml) wird zu jedem Plug aufgenommen. A schießen Abschnitt mit 2-3 Achselknospen wird durch einen schrägen Schnitt herausgeschnitten. Das Explantat wird dann in den Stecker eingeführt und angebaut bei 22 ° C für etwa drei Wochen. Wir halten die Medicago Explantate ohne Bewässerung für die ersten 10 Tage, dann, Wasser sie mit 5 ml Stickstoff-freie Lösung, wenn nötig. Wir fanden, dass das Entfernen der Sprossmeristem könnte die Bildung von Adventivwurzeln zu verringern. 3. Symbiontischen Rhizobien (Sinorhizobium meliloti) Infektion Nach drei Wochen werden einige Adventivwurzeln aus der Steinwolle entstehen. Die hairy root Composite Pflanzen sind Sand oder Vermiculit (sterilisiert) übertragen, mit oder ohne die Steinwolle. Sie sind im Gewächshaus bei 22 ° C, 16 / 8 h Licht / Dunkel-Zyklus, und 300 μmol.m -2. S -1 Lichtintensität für eine weitere Woche. Vor Rhizobien-Infektion, S. meliloti 1201 ist in 50 ml Hefeextrakt-Mannitol-Medium für 7 Tage bei 30 ° C (Tabelle 2, und 6,7) kultiviert. Re suspendiert Rhizobien Zellen sind, um eine endgültige Konzentration von OD 600 = 0,08 unter Verwendung von Stickstoff frei Ernährung Lösung verdünnt. Ein 10-ml frischen Suspension von S. meliloti wurde jedem Verbund-Anlage angewendet, um Knoten zu induzieren. 4. Transgene Root-Identification Zwei Wochen nach Rhizobien Inokulation werden die Composite-Pflanzen durch Waschen mit Wasser bis verwurzelt. Die Wurzeln können leicht von Sand oder Perlite werden in Wasser getrennt. Wir legen den haarigen Wurzeln unter einem UV-Mikroskop (Nikon SMZ1500, Excitation 460-500nm, 505nm Dichroic, Barrier mehr als 510nm). Die transgenen Wurzeln sind GFP positiv und die Adventivwurzeln sind GFP negativ. Wir sammeln dann die Wurzeln according der GFP-Signal, und zählen Sie die Knoten-Nummern, messen Sie die Wurzellänge und berechnen lateralen Wurzel Dichte. Die GFP negativen Wurzeln als Kontrolle verwendet. 5. Repräsentatives Ergebnis In unserem Experiment, das neue Haarwurzeln aus den Explantaten in 2-3 Wochen regeneriert nach A. rhizogenes Inokulation. Unter dem UV-Mikroskop zeigen transgene Wurzeln Durchführung der GFP-Gen starke grüne Fluoreszenz (Abb. 1). Die Höhe der regeneriert Wurzeln und der Anteil der GFP positiven Wurzeln hängen von den Bedingungen der Explantate und das Wachstum Umgebung von Composite plants.On Durchschnitt waren 25% der Wurzeln produziert transgenen haarigen Roots 3. Um die Transformationseffizienz, 1) zu erhöhen die Kunststoffabdeckung doom, wie auf dem Video zu sehen, genügt, um die Feuchtigkeit in das Wachstum Fach für die ersten paar Tage zu halten und Pflanzen benötigen nur wenig Wasser in den ersten Tagen. Übermäßige Bewässerung ist schädlich für hairy root Bildung, 2) die Konzentration von Agrobacterium innoculant ist für die Transformation von Bedeutung. Übermäßige Menge an Zellen sind nicht hilfreich, hairy root Bildung oder Knotenbildung. Für Knotenbildung, die Bewässerung Lösung zu Stickstoff-free Pakete braucht, sonst werden nur wenige Knötchen bilden. Die hairy root Composite Pflanzen lassen sich mit den Keimblättern bzw. entact Sämlinge als Ausgangsmaterial werden. Nur geringfügige Änderungen der oben genannten Protokoll sind ncessary zu haarigen Wurzeln aus anderen Geweben 8 zu erzeugen. Wichtig ist, dass jeder hairy root ein unabhängiges Transformationsereignis. Daher sind die Phänotypen in einem Composite-Anlage beobachtet die Summe von mehreren transforamtion Ereignisse, die durch Wiederholungen in mehreren zusammengesetzten Pflanzen bestätigt werden benötigt Abbildung 1. A. Transgene Wurzeln aus haarigen Wurzeln sortiert werden. B. Knöllchen wurden in der behaarten Wurzel Composite Pflanzen gebildet. Wir setzten 4-Wochen alten M. truncatula hairy root Pflanzen unter dem UV-Mikroskop und dem GFP positive Wurzeln können leicht identifiziert werden. (Roter Pfeil: GFP Wurzel; Gelber Pfeil: non-GFP root) Lager g/200ml ml Brühe / Liter MgSO 4 .7 H 2 O 12,3 2 CaCl 2 .2 H 2 O 14,7 4 K 2 HPO 4 .3 H 2 O 6,8 1 K 2 SO 4 11 4 Fe Cl 3 .6 H 2 O 0,49 2,5 Mikronährstoffe Siehe unten 1 Mikronährstoffe g pro Liter H 3 BO 3 0,142 MnSO 4. H 2 O 0,077 ZnSO 4 .7 H 2 O 0,1725 CuSO 4 .5 H 2 O 0,037 NaMoO 4. H 2 O 0,024 CoCl 2. H 2 O 0,0025 NiSO 4 0,001 Tabelle 1. Nitogen-freie Ernährung Lösung K 2 HPO4 0.5g NaCl 0.1g MgSO 4 · 7H 2 O 0.2g Hefeextrakt 0,4 g Mannitol 10g pH = 6,8 Tabelle 2. Hefeextrakt Mannitol-Medium (pro Liter)