Génération de plantes dans les composites Medicago truncatula Utilisées pour les dosages nodulation

Le protocole suivant a été utilisé pour générer des plantes à racines poilues composites dans un modèle de légumineuses espèce M. truncatula. Des protocoles similaires ont été adaptés pour au moins huit espèces végétales 1-4. Nous avons utilisé M. truncatula plantes racines chevelues composites pour étudier les fonctions des gènes dans les racines et le développement de nodules. Le protocole a été séparé en quatre sections: 1) la préparation de matières végétales; 2) générant plantes à racines poilues composites; 3) l'infection symbiotique Rhizobium, et 4) l'identification racines transgéniques. Nous avons utilisé le vecteur binaire contenant la protéine fluorescente verte (GFP) en tant que journaliste pour le dépistage racines transgéniques dans les plantes composites 3. Comparé aux antibiotiques à base de sélection, GFP-dépistage est rapide, facile et peu coûteux. Dans notre construction, l'ER-expression de gène de la GFP optimisé est entraîné par le promoteur ubiquitine superbe, qui a de forts signaux GFP constitutive dans les racines transgéniques, permettant la distinction facile entre les racines transgéniques et non transgéniques. 1. Préparation des matériaux végétaux M. graines sont récoltées truncautla à partir de plantes cultivées dans une serre (50% d'humidité relative, 16 / 8 h de lumière / obscurité, 22/18 ° C température jour / nuit). Les graines mûres peuvent être stockées à 4 ° C. Environ 100 graines sont scarifiées dans 10 ml d'acide sulfurique concentré (95-98%, Sigma-Aldrich, MO) pendant 10 min avec agitation périodique. Les graines sont rincées 5-7 fois avec de l'eau stérile avec une légère agitation. Les graines sont ensuite trempées dans l'eau à température ambiante pendant 6 heures et conservé à 4 ° C pendant 36-48 heures à synchroniser la germination. Environ 20-30 graines sont réparties sur des sols humides des papiers-filtres placés dans une boîte de Pétri. Ils sont maintenus à 22 ° C, avec 16 / 8 h cycle lumière / obscurité, et 40 μmol.m -2. Intensité de la lumière s -1, pendant 5-6 jours. Plants germés sont transférés dans le sol et placés dans une serre pendant un mois. 2. Génération plantes racines chevelues Composite Des constructions binaires portant des gènes d'intérêt ont été transformés en A. rhizogenes utilisant des protocoles standard. Nous avons conçu un ensemble de vecteurs binaires contenant le gène de la GFP comme marqueur qui facilitent le dépistage des tissus transgéniques. Ces vecteurs contiennent divers promoteurs et tous ont des sites de clonage Gateway (Invitrogen, Carlsbad, CA) pour la sur-expression ou réprimer des gènes ciblés 3,5. A. rhizogenes est cultivée dans 50 ml de milieu LB avec sélection antibiotique approprié à 28 ° C pendant 16-24 heures. Les bactéries sont collectées et remises en suspension à une concentration finale de DO600 = 0,3 dans un exempt d'azote des plantes des nutriments solution (tableau 1 et 6). Pour soutenir la régénération hairy root, une matrice stérilisés à l'appui ("laine de roche", Hummert International, Earth City, MO) est découpé en fiches d'environ 3 cm 3. Nous mettons 4 bouchons dans une boîte de Pétri. Un trou est fourré sur le dessus de chaque fiche à l'aide d'une pipette pour faciliter l'insertion des explants. A. rhizogenes (5 ml) est ajoutée à chaque fiche. Une section tournage avec 2-3 bourgeons axillaires est excisé par une coupe oblique. L'explant est ensuite insérée dans la prise, et cultivés à 22 ° C pendant environ trois semaines. Nous gardons les explants Medicago sans arrosage pour les 10 premiers jours, puis, arrosez-les avec 5 ml d'azote sans solution lorsque nécessaire. Nous avons trouvé que la suppression du méristème apical pourrait diminuer la formation de racines adventives. 3. Symbiotique Rhizobium (Sinorhizobium meliloti) Infection Après trois semaines, quelques racines adventives ressortiront de la laine de roche. Les plantes à racines poilues composites sont transférés à du sable ou de la vermiculite (stérilisée), avec ou sans la laine de roche. Elles sont cultivées en serre à 22 ° C, 16 / 8 h cycle lumière / obscurité, et 300 μmol.m -2. S -1 intensité lumineuse pour une semaine de plus. Avant de rhizobiums infection, S. meliloti 1201 est cultivé dans 50 d'extrait de levure-mannitol ml de milieu pendant 7 jours à 30 ° C (tableau 2 et 6,7). Re-suspendre les cellules de rhizobium sont dilués à une concentration finale de 600 OD = 0,08 solution en utilisant la nutrition azotée libre. Une suspension de 10 ml fraîche de S. meliloti a été appliquée à chaque usine composites pour induire la formation de nodules. 4. Identification des racines transgéniques Deux semaines après l'inoculation de rhizobium, les plantes composites sont déracinés par un lavage à l'eau. Les racines peuvent être facilement séparés de sables ou de la perlite dans l'eau. Nous mettons les racines poilues sous un microscope à UV (Nikon SMZ1500, excitation 460-500nm, 505nm dichroïque, Barrier plus de 510nm). Les racines transgéniques sont GFP-positives et les racines adventives sont GFP négative. Nous avons ensuite recueillir les racines according le signal GFP, et de compter le nombre de nodules, mesurer la longueur des racines, et de calculer la densité des racines latérales. Les racines sont négatives GFP utilisé comme témoin. 5. Résultat Représentant Dans notre expérience, les racines des cheveux nouveaux régénérées à partir des explants en 2-3 semaines après A. rhizogenes inoculation. Sous le microscope à UV, les racines transgéniques portant le gène de la GFP montrent une forte fluorescence verte (Fig 1). Le montant de racines et la partie régénérée des racines GFP-positives dépendent des conditions d'explants et de l'environnement de croissance de plants.On moyenne composite, 25% des racines produites étaient transgéniques racines poilues 3. Afin d'augmenter l'efficacité de transformation, 1) le destin couvercle en plastique, comme le montre la vidéo, est suffisant pour maintenir l'humidité dans le bac de croissance pour les premiers jours, et les plantes ne nécessitent peu d'eau dans les premiers jours. Un arrosage excessif est préjudiciable à la formation des racines velues; 2) la concentration de l'inoculant Agrobacterium est important pour la transformation. Une quantité excessive de cellules ne sont pas utiles à la formation des racines velues ou la formation de nodules. Pour la formation de nodules, la solution d'arrosage doit être exempt d'azote, sinon, quelques nodules se forment. Les plantes à racines poilues composites peuvent être générés en utilisant les cotylédons ou les semis Entact comme matériau de départ. Seules des modifications mineures du protocole ci-dessus sont ncessary pour générer des racines poilues d'autres tissus 8. Surtout, chaque racine velue est un événement de transformation indépendants. Par conséquent, les phénotypes observés dans une usine de composites sont la somme des événements transforamtion plusieurs devaient être confirmés par des répétitions dans de multiples plantes composites Figure 1. A. racines transgéniques peuvent être triés à partir des racines poilues. B. Nodules ont été formés dans les plantes racines chevelues composites. Nous avons placé quatre semaines, âgé de M. plantes truncatula hairy root sous le microscope à UV et les racines GFP-positives peuvent être facilement identifiés. (Flèche rouge: root GFP; flèche jaune: non-GFP racine) Stock g/200ml ml de stock / litre MgSO 4 .7 H 2 O 12,3 2 CaCl 2 .2 H 2 O 14,7 4 K 2 HPO 4 .3 H 2 O 6.8 1 K 2 SO 4 11 4 Fe Cl 3 .6 H 2 O 0,49 2.5 Micronutriments Voir ci-dessous 1 Micronutriments g par litre H 3 BO 3 0,142 MnSO 4. H 2 O 0,077 ZnSO 4 .7 H 2 O 0,1725 CuSO 4 .5 H 2 O 0,037 Namoo 4. H 2 O 0,024 CoCl 2. H 2 O 0,0025 NiSO 4 0,001 Tableau 1. Solution Nutrition Nitogen libre K 2 HPO4 0.5g NaCl 0.1g MgSO 4 · 7H 2 O 0.2g Extrait de levure 0.4g Mannitol 10g pH = 6,8 Tableau 2. Extrait de levure moyennes mannitol (par litre)