Het bestuderen van de neurale basis van Adaptive locomotorisch gedrag bij insecten

1. De Walking Surface De zwarte loopvlak is opgebouwd uit twee vernikkelde koperen platen permanent verbonden zij aan zij en elektrisch geïsoleerd van elkaar door een 2 mm brede strook van 2-componenten epoxy lijm (UHU plus, UHU GmbH, Duitsland) direct onder de lengte-as van het dier. Ze produceren een totale oppervlakte van 13.5×15.5cm (Figuur 1). De scheiding van de half-vliegtuigen voor de linker en rechter benen kunnen onafhankelijke tarsale contact bewaking voor een enkele poot aan elke kant. De plaat wordt gesmeerd met een glycerine / water mengsel in een verhouding van 95 delen glycerine tot 5 delen verzadigde NaCl-oplossing voor de gladheid en elektrische geleidbaarheid te brengen, de viscositeit is ongeveer 430cStokes (Shankar en Kumar, 1994). Het mengsel wordt rechtstreeks aangebracht op het oppervlak en is verspreid met een stuk zacht weefsel voor een totale dikte van 0.1-0.2mm te verzekeren. 2. Optische stimulatie Setup Wandelen episodes worden opgewekt met behulp van twee projectoren zoals beschreven door Scharstein (1989) naar een gestreept patroon project op twee ronde, gemalen glas schermen (diameter 130mm, Marata schermen, Linos Fotonica, Göttingen, Duitsland), die zich op een afstand van ca.. 70mm uit de ogen, en onder een hoek van 45 ° aan de linker en rechter voorzijde van de plaat (Fig.1). De golflengte van het gestreepte patroon wordt constant gehouden op λ = 21 °. Het contrast frequentie van de bewegende stimuli kan worden gevarieerd tussen de 0,35, 0,72, 1,07 en 1.49Hz. Omdat de reactie van de dieren hangt alleen af ​​van het contrast frequentie ω / λ (ω = hoeksnelheid, λ = patroon golflengte) als het patroon contrast is hoog genoeg (Fermi en Reichhardt, 1963), hebben we niet afwijken λ de hele experimenten . De luminantie van de heldere strepen aan de zijkant van het dier is ongeveer 15cd/m2 en het contrast 0,8. De verbinding oog van de wandelende tak (Carausius morosus) heeft 24 ommatidia in het dorso-ventrale as (Friza, 1928) en een paar meer in de rostro-caudale as. Omdat de divergentie hoek van de wandelende tak oog is gemiddeld 6,2 ° (Jander en Volk-Henrichs, 1970) ons patroon golflengte is ongeveer 4 keer de hoek van de ommatidia. De experimenten worden opgezet in een verduisterde kooi van Faraday en uitgevoerd in een donkere kamer bij 20-22 ° C. Naar voren lopen wordt veroorzaakt door een progressieve patroon op beide schermen, waar de strepen op elk scherm naar de rand, of een enkele zwarte balk op een witte achtergrond geplaatst tussen de schermen Draaien wordt veroorzaakt door strepen bewegen in dezelfde richting op beide schermen. We hebben niet gevonden een correlatie tussen de snelheid van de bewegende strepen en de hoek van de bocht. Zodra de luminantie van de gestreepte patroon is ingesteld voor het induceren lopen, dat doet het meestal niet nodig verdere aanpassingen, maar het kan worden aangepast voor verschillende dieren naar gelang de behoefte door de spanning van de halogeenlampen in de projectoren. 3. Voorbereiding van het proefdier Vrouwelijke volwassen wandelende takken (Carausius morosus) zijn gelijmd (tandheelkundig cement, ProTempII, 3M ESPE, Seefeld, Duitsland) ventrale zijde naar beneden op een dun balsa stick (3x5x100mm, BxHxL), die is ingevoegd in een koperen buis die met meerdere connectors heeft. Het dier wordt gehouden voor ongeveer een minuut tot de lijm is ten minste gedeeltelijk verhard. Het hoofd en de benen steken aan de voorkant en zijkant van de deuvel om het vrije verkeer mogelijk te maken. Het gebied van de coxae van alle benen evenals het grootste deel van de buik moet worden gelaten vrij zijn van lijm. Insect hoofd, borstkas, en de distale uiteinden van elk dijbeen en scheenbeen zijn gemarkeerd met fluorescerende pigmenten (Dr. Kremer Farbmühle, Aichstetten, Duitsland), gemengd met tandheelkundig cement voor later video tracking. 4. Plaatsing van EMG elektroden Spieractiviteit van verschillende beenspieren, zoals in dit voorbeeld, is de gradenboog en oprolmechanisme coxae spieren, die zich in de thorax en de oorzaak protractie (voorwaartse beweging) en retractie (achterwaartse beweging) van het been, opgenomen door middel van EMG-elektroden geïmplanteerd in de thorax. Alle EMG-opnames zijn differentieel versterkt. Het signaal was 100x versterkt in een voorversterker (elektronica workshop, Zoölogisch Instituut, Keulen), band-pass gefilterd, (100Hz-2000Hz), verder versterkt (10x), en geïmporteerd via een AD converter in spike2 (Vers.5.05, CED, Cambridge, Verenigd Koninkrijk). De elektroden zijn gemaakt van gecoat koperdraden (Elektrisola, Eckernhagen, Duitsland; 47μm buitendiameter). Voor de ene elektrode, twee draden eerst worden ingesmeerd met lijm, dan zijn de twee kleverige draden om elkaar heen gedraaid Aan de ene kant de twisted draadeinden worden vastgesoldeerd aan een mini-stekker. Aan de andere kant de draden zijn afgesneden te reinigen uiteinden leveren zonder isolatie voor de opname in het dier. De EMG-elektroden zijn Plugged in de kleine connector aan het eind van de koperen pijp. Een minuten pin wordt gebruikt om kleine gaten in de cuticula De uiteinden van de elektrode worden vervolgens gescheiden en ingebracht in een spier op ongeveer 1 mm afstand van elkaar, die in onze ervaring, een goed signaal geeft ruis verhouding. Zorg ervoor dat u niet aan de elektroden te diep in te voegen in de spier in om de schade te voorkomen. Figuur 2 toont de locatie van de elektroden in de thorax van het dier. Figuur 3 toont een dier met de elektrode draden op zijn plaats. We maken gebruik van een kleine druppel histoacrylic lijm (3M Vetbond, St.Paul, MN, USA) om de draden op hun plaats. Een grond draad wordt ingebracht in de buik. 5. Registratie van de Tarsale Contact Tarsale contact is altijd opgenomen, samen met EMG sporen. Sinds het gladde oppervlak is verdeeld in twee helften, kan maximaal twee contralaterale tarsale contacten worden geregistreerd op hetzelfde moment. Voor dit doel wordt het been gebruikt als een "switch" om een ​​circuit te sluiten tussen de plaat en de versterker. Stroom kan worden toegepast op de platen afzonderlijk door twee sockets aan de basis van elke plaat. We kunnen genereren twee vierkante golf signalen met 2-4MV amplitudes met een pulsgenerator (Model MS501, elektronica workshop, Zoölogisch Instituut, Keulen) die fase vertraagd 90 °. De signalen worden verzwakt door de 60 dB (/ 1000) en toegepast op de twee helften van het gladde oppervlak. In dit experiment gebruiken we alleen een van de twee signalen. Het is tegelijkertijd ingevoerd in een lock-in versterker als een referentie signaal. De 2-fase lock-in-versterker (elektronica workshop, Zoölogisch Instituut, Keulen) selectief versterkt alleen signalen van dezelfde frequentie en fase als de meegeleverde referentie signaal. Een tweede kanaal detecteert alleen de 90 ° fase vertraagde signaal. Ruis signalen op andere frequenties dan de referentie-frequentie zijn afgewezen en hebben geen invloed op de meting. De versterker uitgangssignaal wordt toegevoerd aan een AD-converter (Micro 1401k II, CED, Cambridge, VK) en gedigitaliseerd met behulp van Spike2. Tussen de touch-down-en-off lift van de tarsus op en van de gladde ondergrond, stroom van de plaat door de tarsus en scheenbeen in de koperdraad (zie hieronder: 5,3 tot 5,8). De gekozen versterker heeft een hoge ingangsweerstand (1MΩ) en het signaal spanning is erg klein om te voorkomen dat die het loopgedrag van het dier. De stroom die door tarsus en de tibia is tussen de 2 en 4NA. Het signaal doorlooptijd tijdens de touch-down, tussen de toegang tot het smeermiddel en het contact met het oppervlak is minder dan 1 ms. Het contact signaal overgang tijdens de lift-off is minder steil en meer vertraagd. Dit is te wijten aan de vertraagde scheuren van het smeermiddel van het spronggewricht door een capillaire opstijging effect en als gevolg van beweging van het been, zonder volledige lift-off in zwaaifase. De koperen pijp met de balsa stok waaraan het dier is gelijmd wordt ingevoegd in een micromanipulator om hoogteverstelling van het dier tussen de 7 en 12 mm boven het gladde oppervlak, dat op de hoogte komt overeen tijdens de gratis wandel mogelijk te maken. Om de stroom te meten wanneer het insect tarsus van de bewaakte been op de grond, is een draad (47μm diameter) gesneden van ongeveer 15 cm lange stukken. De isolatie van een koper wordt verwijderd door het verbranden van het weg met alcohol. Een lus is gevormd met een uiteinde van de draad en gleed over de tarsus van het dier De lus wordt gebonden aan het distale uiteinde van het scheenbeen om een ​​goed contact tussen dier en draad te bieden. De draad wordt vervolgens vastgesteld op de borstkas van het dier met een daling van twee-componenten lijm (ProTempII, zie boven), en aangesloten op de differentiële versterker door middel van een alligator klem. Ter verbetering van de geleidbaarheid van de draad aan de uiteinden, een daling van de elektrode crème wordt toegepast (Marquette Hellige, Freiburg, Duitsland) op het gebied van contact. De signaalsterkte wordt dan getest op de monitor. Als gevolg van de low-pass filter eigenschappen van de lock-in-versterker (10ms tijd constant) en de geleidelijke lift-off/touch-down van het spronggewricht, het signaal is niet een exact vierkant signaal. Men moet dan ook passende drempels dicht bij de overgang punt in te stellen naar de precieze timing van de tarsale contact vast te stellen en controleer handmatig elke gebeurtenis bepaald door de digitalisering software. Op basis van de tarsale contact, definieerden we het tijdstip waarop de tarsus van een bepaald been was op de grond als houding en het tijdstip waarop het werd in de lucht als zwaaifase. De trigger signaal voor de camera is tegelijk opgenomen met de EMG op te sporen en de tarsale contact-signaal, en maakt het mogelijk een nauwkeurige frame per frame correlatie van gedrag en opgenomen sporen. 6. Optische Opname van beenbewegingen voor digitale Analyse De tijdelijke frequentie van de wandelende takken op een gladde ondergrond kunnen bereiken 3-4Hz (Graham en Cruse, 1981). Voordat u opneemt lopen sequenties, is een spiegel geplaatst op een hoek van 45 ° achter het dier om een ​​extra visuele monitor voor touch-down te hebben. De camera is van buitenaf geactiveerd en foto's worden ingevoerd in een PC via een FireWire-interface. We nemen lopen sequenties van boven met een high speed video camera (Marlin F-033C, Allied Vision Technologies, Stadtroda, Duitsland) op 100fps digitaal te analyseren van de beenbewegingen, en correleren ze met EMG-activiteit en tarsale contact. Tijdens de opname van het lopen sequenties, is het dier verlicht met blauwe LED-arrays (30-50V DC, luminantie 24cd, Electronics Workshop, Zoölogisch Instituut, Universiteit van Keulen), die worden aangepast in intensiteit van de fluorescente markers te verlichten. Volgens de literatuur (Schlegtendal, 1934), doe wandelende takken niet in het bezit kleuren zien en we hebben niet waargenomen een negatief effect van het UV-licht verlichting op de draaiende reactie. Een gele filter voor de cameralens onderdrukt de korte golflengte van het licht activering en geeft een hoger contrast voor de video-opnames. De video-bestanden kunnen worden geanalyseerd met behulp van motion tracking software (WINanalyze, Vers.1.9, Mikromak service, Berlijn, Duitsland). 7. Het opnemen van Walking Sequences Als controle, eerst een wandeling sequentie met een intact dier wordt geregistreerd. De snelheid van de gestreepte patroon is ingesteld, en het patroon en de video-opname zijn ongeveer begonnen op hetzelfde moment. Als het dier niet spontaan start motoriek, kan het worden gestimuleerd op de buik met een borstel (Bäßler en Wegener, 1983), of door een trekje van lucht naar de antennes. In dit geval, de dieren raakte aan de linkerkant van de buik hebben de neiging om linksaf te slaan en vice versa. Het gestreepte patroon blijft bewegen totdat het dier stopt met lopen of tot na 3 minuten van continue opnamen. Om te testen hoe ver de spieractiviteit in een been is afhankelijk van de zintuiglijke input uit het naburige benen, is het dier aangezet tot haar benen autotomize. De site van autotomie sluit zich vanzelf binnen enkele seconden. Een voorbeeld van een dier met autotomized voor-en achterbenen is weergegeven in figuur 3. Bijvoorbeeld, voor experimenten met dieren met slechts een middelbare been, we veroorzaken autotomie van de pro-en metathoracic benen door te knijpen de proximale femur met een pincet (Schmidt en Grund, 2003) of knip de benen op het niveau van de coxae na de opname van de intacte dier. Na dat een minimum van 30 minuten voor de hersteltijd wordt gegeven aan het dier. Dan gaan we opnemen nieuwe wandel-sequenties als voorheen. In de gereduceerde voorbereidingen, we moeten vaak braken lopen met behulp van verf penseelstreken. 8. Representatieve resultaten: Figuur 1 Experimentele opstelling, A:. Foto van een wandelende tak vastgebonden boven het gladde oppervlak, gemarkeerd met fluorescerende pigmenten voor been tracking en bedraad voor EMG opname en tarsale contact meting. B: elektrisch schema voor dubbele been tarsale contact opnemen tijdens het lopen op de gladde ondergrond. Figuur 2. Posities voor de plaatsing van EMG elektroden in de gradenboog en oprolmechanisme spieren in de borstkas van de wandelende tak middelste been. ML: middelste been, FL: voorpoot . Figuur 3 Stick insect met EMG draden in de pro-en oprolmechanisme spieren van het middelste been op zijn plaats; voor-en achterbenen zijn verwijderd om het effect van de aanwezigheid van de naburige benen studie over de kinematica en de spieractiviteit van de middelste poten in de verminderde voorbereiding. Figuur 4. Voorbeeld spoor van oprolmechanisme EMG-activiteit met een referentie-signaal van de tarsale contact in een binnenkant midden been tijdens het draaien. Aan het begin van het trace (eerste blauwe box) het oprolmechanisme is actief tijdens houding, terwijl het been heeft contact met de grond ("gesloten circuit"), wat aangeeft dat het been maakt naar voren stappen, na een korte schakelaar (tweede blauwe doos), de oprolmechanisme is actief tijdens swing, terwijl de been in de lucht ("open circuit", de derde blauwe doos), met het optreden van de achteruit gerichte stappen. Figuur 5. Schermafbeelding van een opname van de gradenboog (bovenste spoor) en retractor (midden sporen) spieren en de gelijktijdig opgenomen tarsale contact trace (bodemtrace). Let op de wisselende activiteit in de EMG-sporen die overeenkomt met de activiteit van de twee spieren in de stap-cyclus, dat is gradenboog activiteit vlak voor en tijdens deswing, toen de tarsale contact spoor signalen verlies van contact met de grond, en retractor activiteiten tijdens en na touch-down van het spronggewricht, wanneer been is in houding. De insert geeft de bijbehorende video-bestand dat overeenkomt met deze opname die wordt gebruikt om het gedrag van het dier te controleren.