Esaminando la dinamica conformazionale delle proteine ​​di membrana In situ Con il sito-diretta Etichettatura fluorescenza

1. Espressione di proteine Clonare la proteina di membrana di interesse in un vettore adatto per l'espressione degli ovociti di Xenopus laevis come pTLN pSG01MX 11 o 12. Ottimizzato vettori contengono sia 5 'e 3' Xenopus laevis β-globina regioni non tradotte 11,12, un sito di restrizione unico, e un sito promotore RNA trova davanti al 5 'UTR 11. Questi componenti sono necessari per l'espressione ottimale negli ovociti, linearizzazione del plasmide prima sintesi di mRNA e la sintesi di mRNA, rispettivamente. 2. Cisteina Mutazione Un Kyte-Doolittle trama è impiegato per identificare i domini transmembrana della proteina bersaglio mediante sequenza aminoacidica della proteina (ProtScale, ExPASy) 13. I dati vengono visualizzati come idrofobicità rispetto al numero di sequenza. Residui che visualizzano i valori positivi sono probabilmente trovati nel dominio transmembrana. Utilizzare questo grafico per determinare i residui più probabile situato all'interfaccia tra i domini transmembrana ed extracellulare che sarà mutato in cisteina. Come determinare l'interfaccia del dominio transmembrana e della regione extracellulare non possono essere previsti con certezza completa utilizzando il Kyte-Doolittle trama, è importante esaminare una serie di residui che si prevede di essere a livello di interfaccia. Questa regione della proteina è stato selezionato per il movimento previsto del fluorophore.During un cambiamento conformazionale, il fluoroforo si muoverà tra un ambiente idrofile e idrofobe o tra una tempra più acqua e meno ambiente tempra in acqua. Ognuno di questi cambiamenti previsti in ambiente si tradurrà in un cambiamento di intensità di fluorescenza. QuickChange mutagenesi sito-diretta Kit (Stratagene) è usato per generare singolo costruisce cisteina extracellulare accessibile. In breve, mescolare 5 ml di tampone di reazione 10X, 2 l di 5 ng / mL di DNA plasmidico, 1,25 microlitri ciascuno di 100 ng / mL avanti e indietro primer, 1 ml di dNTP (100 mm), e il 39,5 ml di bidistillata acqua. Infine, aggiungere 1 l di DNA polimerasi PfuTurbo (Stratagene). Il primer utilizzata in questa fase devono essere progettati con la mutazione in un residuo cisteina extracellulare di interesse. Programmare il termociclatore alle seguenti specifiche: 1 ciclo a 95 ° C per 30 secondi, 12-18 cicli a 95 ° C per 30 secondi, 55 ° C per 1 minuto e 68 ° C per 1 minuto per lunghezza kb plasmide. La temperatura di ricottura (55 ° C) è calcolato direttamente dalla temperatura di fusione di ciascun primer. Un passo finale può essere programmato per mantenere la temperatura a 4 ° C se la reazione viene eseguita durante la notte. Il numero di cicli dipende dalla mutazione. Usa 12 cicli di mutazioni puntiformi, 16 cicli per un singolo cambiamento aminoacido, o 18 cicli per inserimenti multipli di aminoacidi. Aggiungere 1 ml di DpnI (New England Biolabs) alla miscela di reazione, mescolare pipettando, e centrifuga (6000 rpm) per 1 minuto. Incubare per 1 ora a 37 ° C a bagnomaria. Scongelare top 10 elettro-cellule competenti (Invitrogen) su ghiaccio e incubare sterile SOC multimediali (20 mg / ml triptone, 5 mg / ml di estratto di lievito, 1 mg / mL di NaCl, 0,4 mg / ml di KCl, 0,02 M Mg 2 +, 0,02 M di glucosio, ddH2O) a 37 ° C fino al momento dell'uso. Aliquota 20 l di cellule in provette per centrifuga da 1,5 ml e aggiungere 1 ml di DNA digerito alle cellule. Riempire il Cell-Porator (Life Technologies) con acqua ghiacciata, impostare la capacità a 330 uF, di carica a digiunare, e la resistenza alla tensione-Booster a 4 kΩ. Pipettare 20 ml di cella / DNA soluzione nella cella-porator cuvette. Posizionare la cuvette in Cell-Porator, chiudere il coperchio, collegare il cavo di alimentazione, e girare la manopola per la cuvetta corretta. Impostare l'alimentazione di caricare e hold 'a' fino a quando la tensione si legge 430. Portare il quadrante in braccio e innescare stampa. Se c'è un rumore di scoppio, ritentare l'elettroporazione. Pipettare le cellule dalla cuvetta e trasferirli a 1,5 ml di SOC media. Incubare per 1,5 ore a 37 ° C con agitazione. Trasferire il 30 microlitri della soluzione SOC / cella a LB / agar ampicillina (10 mg / ml triptone, 5 mg / ml estratto di lievito, 10 mg / ml NaCl, 15 mg / ml di agar, DDH 2 O e 100 ng / mL ampicillina ). Stendere le cellule sulla piastra e incubare la piastra a 37 ° C durante la notte. Colonie raccolta singolo dai piatti e inoculare 5 culture ml contenente LB / ampicillina (10 mg / ml triptone, 5 mg / ml di estratto di lievito, 10 mg / mL di NaCl, 100 ng / mL ampicillina DDH 2 O) dei media. Agitare a 37 ° C per 16-20 ore. Eseguire un miniprep DNA utilizzando il kit di plasmidi NucleoSpin (Macherey-Nagel). Qualitativamente esaminare il prodotto mediante elettroforesi su gel di agarosio. Quantitiate la resa di DNA utilizzando un NanoDrop 2000c Spettrofotometro (Thermo Scientific). Verificare l'inserimento della mutazione di sequenziamento del DNA. <p class="Jove_title"> 3. mRNA di sintesi Per linearizzare il DNA, digerire 3 g di DNA plasmidico in 50 litri di volume di reazione con 5 microlitri di buffer appropriato e 1 ml di enzima di restrizione per 1 ora a 37,0 ° C. Utilizzando l'Alto-Pure kit di purificazione dei prodotti PCR (Roche Applied Science), aggiungere 350 microlitri di buffer vincolante al flaconcino digerire e mescolare brevemente nel vortex. Questo kit è utilizzato in quanto contiene guanidiniumisothiocyanate che rende il prodotto di qualità RNA. Luogo colonne di rotazione in tubi di raccolta e di carico della colonna con la soluzione di DNA digerire. Centrifugare a 18.000 g per 20 secondi e scartare flow-through. Aggiungere 500 ml di tampone di lavaggio alla colonna. Centrifugare 20 secondi a 18.000 g ed eliminare il flusso attraverso. Aggiungere 200 ml di tampone di lavaggio alla colonna. Centrifugare 30 secondi o fino a quando è asciutto colonna a 18.000 g. Montare la colonna di girare in un autoclave tubo 1,5 ml per centrifuga e aggiungere 50 ml di DEPC-acqua trattata alla colonna. Eluire per centrifugazione per 30 secondi a 18.000 g. Concentrare il DNA eluito a circa 15 microlitri che si traduce in 0,5 mg in 3 ml di soluzione. Scegliere la corretta mMessage mMachine Kit (Ambion) secondo la sequenza promotore sito nel DNA plasmide (SP6, T7). Aggiungere 5 l 1 NTP-cap mix, 3 microlitri di DNA linearizzato dal passaggio precedente, 1 microlitri di buffer di trascrizione, e 1 ml di RNA polimerasi appropriato. Incubare per 1,5-2 ore a 37 ° C. Aggiungere 12,5 ml di LiCl dal kit, 15 microlitri DEPC acqua, mescolare brevemente (non vortex), centrifugare a 11.000 g per 10 secondi, e conservare a -20 ° C per almeno 30 minuti per le precipitazioni. Pre-cool centrifuga a 4 ° C e centrifugare almeno 15 minuti alla massima velocità dopo precipitazioni. Dopo la centrifugazione una pallina marrone dovrebbe essere visibile nella parte inferiore del tubo. Accuratamente e rimuovere completamente il surnatante e aggiungere 150 ml di etanolo al 70% RNA grado raffreddato a -20 ° C. Centrifugare a 4 ° C per 5 minuti alla massima velocità. Rimuovere il surnatante completamente, per breve tempo asciutto (1-2 minuti) in un Vacufuge Eppendorf Plus, e sciogliere l'ormai bianco pellet in 12 ml di acqua DEPC. Quantitiate la resa di mRNA usando un NanoDrop 2000c Spettrofotometro (Thermo Scientific). 4. Ovocita di rimozione Questo protocollo è stato approvato da Animal Care Istituzionali WPI e del comitato Usa. Prima del funzionamento, la rana dovrebbe essere a digiuno per 12 ore per prevenire il vomito durante l'intervento. Ottenere una soluzione di 0,5-3,0 g MS-222 disciolto in acqua. Aggiungere bicarbonato di sodio fino a quando la soluzione ha un pH 7,0-8,0. MS-222 è usato come anestetico per la rana durante l'intervento. E 'importante indossare guanti di nitrile in ogni momento durante la manipolazione MS-222 e preparare la soluzione sotto una cappa chimica Immergere la rana in MS-222 la soluzione fino a quando la rana ha perso il raddrizzamento e riflessi pizzico piedi. Per controllare insensibilità, pizzicare la punta della rana. Posizionare la rana sul lato dorsale sul lato assorbente di un pad pannolino bagnato. Questo evita danni alla pelle della rana. Tenere un tovagliolo di carta bagnato vicino alla rana in ogni momento, come la rana deve essere tenuto umido durante tutto l'intervento. Se gli occhi della rana sono aperti, è importante bagnare con soluzione salina. Se la rana mostra segni di risveglio, versare la soluzione anestetica sulla rana e attendere che la rana non risponde. Eseguire un pizzico secondo dito del piede prima di continuare la procedura. Fai una piccola incisione celomatica a sinistra oa destra della linea mediana della rana. Le incisioni devono essere effettuate in modo alternato con interventi successivi. Portare l'ovaio verso l'esterno della rana e rimuovere l'ovaio. Evitare di toccare le ovaie per la pelle della rana. Se l'emorragia si verifica, applicare una pressione con una sterile Q-tip fino a quando l'emorragia si ferma. Sutura l'incisione utilizzando un modello di sutura interrotta con 3,0-4,0 sutura Vicryl materiale Ethicon (Johnson & Johnson). Durante la sutura, utilizzare strumenti chirurgici per legare un nodo alla volta ed evitare di toccare la pelle della rana. E 'anche importante per la sutura celomatica e strati di pelle separatamente. Ciò è coerente con le linee guida NIH per uova e la raccolta degli ovociti di Xenopus laevis (vedi: http://oacu.od.nih.gov/arac/XenopusOocyte_101007_Fnl.pdf ). Dopo l'intervento chirurgico, la rana non deve subire un'operazione per almeno 2 mesi. Dovrebbe anche essere determinata se la rana è abbastanza sano di sottoporsi a interventi chirurgici successivi. Un massimo di 6 interventi chirurgici possono essere eseguiti su ogni rana con il terminale di chirurgia 6 ° essere. 5. Ovocita Defoculation e iniezione di mRNA Il lobo ovarico isolato è diviso con le forbici in parti più piccole. Le zolle sono trasferiti in soluzione di Ringer + Ca 2 + con collagenasi (8,6g / L di NaCl, 0,3 g / L KCl, e 0,33 g / L di CaCl 2). Agitare delicatamente la soluzione di analisi, per 2 ore a 18 ° C. Se la maggior parte ovociti sono separati, lavare gli ovociti con la soluzione di Ringer – Ca 2 + (8,6 g / L di NaCl e 0,3 g / L KCl). Incubare ovociti per dieci minuti in soluzione di Ringer – Ca 2 +. Trasferimento ovociti alla Soluzione Ringer + Ca 2 +. Iniettare ovociti con 25 ng di mRNA, in un volume finale di 50 nL con la II Nanoject Auto-nanoliter Injector (Drummond), con 3,5 "Drummond tubi capillari. Nota: La quantità di mRNA varia a seconda della proteina bersaglio. Dopo l'iniezione, gli ovociti incubare 3-7 giorni in soluzione di Ringer (90 mM NaCl, 2 mM KCl, 5 mM MOPS, 2 mM CaCl 2, pH 7,4) e 1 mg / ml di gentamicina a 18 ° C al buio 8. 6. Site-specific Etichettatura fluorescenza Prima della misura, incubare ovociti per 45 minuti in tampone di caricamento (110 mM NaCl, 2,5 mM citrato di sodio e 10 mM MOPS / Tris a pH 7,4) e 45 min in post-tampone di caricamento (100 mM NaCl, 1 mM CaCl 2, 5 mM BaCl 2, 5 mM NiCl 2, e 10 mM MOPS / Tris a pH 7,4) per aumentare la concentrazione intracellulare di Na + 14. Per le misure di fluorescenza, gli ovociti incubare in un post-carico del buffer che contiene 5 mM del fluoroforo desiderato [ex. tetrametilrodamina-6-maleimmide (TMRM) o fluoresceina-5-maleimmide (FM)] per 5-10 minuti. Dopo l'etichettatura fluoroforo, lavare gli ovociti esaustivo con coloranti senza post-tampone di caricamento 3. 7. Elettrofisiologia Fai microelettrodi tirando borosilicato capillari (1B150F-4, strumenti di precisione mondiale) con un estrattore micropipetta (modello PC-10, Narishige). Riempire gli elettrodi con 3 M KCl e testare la resistenza. La resistenza deve essere compreso tra 0,5-1,5 MΩ 15. Dotare il microscopio a fluorescenza (Carl Zeiss, Axio Examiner microscopio a fluorescenza) con un filtro 535DF50 eccitazione, un EFLP 565 emissione filtro, e uno specchio 570DRLP dicroico (Omega Optical) per esperimenti cisteina scansione. Mettere l'ovocita in una camera di RC-10 (Warner Instruments) sul palco microscopio a fluorescenza e inserire delicatamente gli elettrodi realizzati nel citoplasma dell'ovocita. Utilizzando un Turbo Tec-05X amplificatore (NPI Electronics), tenere premuto il potenziale di membrana ad un valore costante e misurare il flusso di ioni attraverso la membrana di scambio seguente soluzione o modificando il potenziale di membrana. Per i concorrenti misure di fluorescenza, utilizzare un tungsteno da 100 W fonte di luce per eccitare il fluoroforo donatore e un PIN-022A fotodiodo (United Technologies Detector) per rilevare i cambiamenti di intensità di fluorescenza. Sia l'amplificatore e fotodiodo sono interfacciati, tramite un sistema di acquisizione dati Digidata 1440A (Axon Instruments), con un computer utilizzando il software pCLAMP10 (Axon Instruments) per l'acquisizione dati e la registrazione. Per la scansione cisteina, misura la variazione di intensità di fluorescenza a stazionaria passi corrente tensione usando che sono controllati da pCLAMP 10 software (Molecular Devices). A seconda della proteina di membrana di interesse, la soluzione extracellulare è stata progettata per garantire corrente stazionaria. Correlare i cambiamenti di intensità di fluorescenza a misurazioni funzionali della proteina bersaglio. 8. Misure anisotropia e determinazione dei vincoli di distanza. Misure anisotropia deve essere assunto insieme a misure di distanza da 8 a calcolare la gamma di κ 2 valori. Anisotropia misura la mobilità relativa del fluoroforo dovuti alla rotazione 16. Utilizzando filtri polarizzati (Linos Fotonica Inc.), misurare la luce paralleli e perpendicolari emessa da FM o eccitazione TMRM segue con luce polarizzata in aminoacidi di interesse. Le misurazioni vengono effettuate in condizioni di scambio soluzione 8 e il potenziale di membrana costante per determinare la mobilità dei fluorofori. Anisotropia è data da r = (I | |-I ⊥) / (I | | + 2I ⊥) dove | | è la luce emessa in parallelo e ho ⊥ è la luce emessa perpendicolare 16. Per calcolare l'errore nelle misurazioni a distanza, κ 2 max = 2 / 3 (1 + F + F ra rd + 3F ° * F ra) e κ 2 min = 2 / 3 (1 – (° F + F ra) / 2 ) dove F rd = (r d / r o) 0,5 e ra F = (r A / R o) 0,5; r a è anisotropia di TMRM, r d è anisotropia di FM, e r o è anisotropia fondamentale di ogni fluoroforo 8 . Per misurare vincoli di distanza, usare un oloenzima che ha due resid accessibile cisteina extracellulareUES. Come gli ovociti si terrà presso un potenziale di membrana costante e distanza quindi costante durante le misure, non ha bisogno di essere un cambiamento di fluorescenza in funzione dello stato conformazionale della proteina. Incubare gli ovociti in un tampone di caricamento messaggio contenente 1 mM FM (fluoroforo accettore) e 4 TMRM mM (fluoroforo donatore) per 30 minuti in ghiaccio al buio, o solo 1 microM FM. Questo consente di effettuare misurazioni per holoenzymes etichettati con e senza fluoroforo accettore 8. Dotare il microscopio con un filtro di eccitazione 475DF40, 530DF30 emissione filtrare e 505DRLP specchio dicroico. Misurare la dipendenza temporale del donatore sbiancamento in presenza e in assenza del fluoroforo accettore. Durante il periodo di tempo di queste misurazioni, il flusso di soluzione deve essere continuo. In caso contrario, un aumento di calore indotto fluorescenza nel tempo possono essere osservati. La differenza di fotodistruzione con e senza il fluoroforo accettore viene utilizzato per calcolare la distanza tra i due residui. Holoenzymes contenente solo il fluoroforo donatore sperimenterà un tasso più veloce di fotodistruzione holoenzymes con un fluoroforo accettore. Holoyenzymes contenenti sia un donatore e fluoroforo accettore esporrà i tassi fotodistruzione lento quando in stretta vicinanza l'uno all'altro 8. Utilizzando la funzione CLAMPEX in pClamp10, la media dei risultati delle fotodistruzione di fluoroforo donatore per un minimo di quattro registrazioni degli ovociti. Una volta che i risultati sono stati in media, utilizzare una funzione esponenziale (monoesponenziale, biesponenziale) per ottenere una curva di regressione. La curva di regressione può essere usata per determinare la costante di tempo per la fotodistruzione di fluoroforo donatore con e senza l'accettore. Determinare l'efficienza del trasferimento di energia data dalla formula E = 1-Γ DA / Γ D 17, dove GDA si riferisce al tempo costante per il donatore / accettore coppia fluoroforo e Γ D si riferisce alla costante di tempo solo per il fluoroforo donatore. Utilizzando il Förster equation17, E = 1 / (1 ​​+ R 6 / R o 6), la distanza tra residui di cisteina etichettati può essere determinato, E è l'efficienza FRET, R è la distanza tra il donatore e fluoroforo accettore, e R o è la distanza di efficienza del 50% per il donatore e accettore abbinamento 17. R o è governato dall'equazione R o = (9.7×10 3 JΦ D n -4 κ 2) dove J è la sovrapposizione spettrale normalizzato di emissione e di assorbimento donatore accettore, Φ D è la resa quantica di emissione del donatore senza un fluoroforo accettore, n è l'indice di rifrazione, e κ 2 è il fattore di orientamento per dipolo-dipolo 8. 9. Il movimento relativo delle subunità proteiche Utilizzare i costrutti cisteina doppio che sono etichettati con fluorofori accettore e donatore. Per questi esperimenti, la variazione di distanza tra i due residui di cisteina sarà misurato. Poiché questo è il caso, la fluorescenza seguente etichettatura intensità ad ogni residuo dovrebbe essere indipendente dallo stato conformazionale della proteina 8. Così, qualsiasi cambiamento nel trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza sarà il risultato di una variazione di distanza tra il donatore e accettore fluorofori. Dotare il microscopio con un filtro di eccitazione 475AF40, 595AF60 emissione filtro e 505DRLP specchio dicroico. Per questi esperimenti, il donatore è eccitato e la fluorescenza del fluoroforo accettore viene misurato. Utilizzare il metodo appropriato (tensione, legante, la soluzione di cambio) per attivare la proteina di membrana e, contemporaneamente, misura la variazione di intensità di fluorescenza. Un aumento dell'intensità della fluorescenza indica che i due fluorofori e quindi due residui stiamo avvicinando tra loro. Una diminuzione di intensità di fluorescenza indica che i due fluorofori e quindi due residui si stanno muovendo più lontani. Infine, nessun cambiamento di intensità di fluorescenza indica che i due fluorofori e quindi due residui sono alla stessa distanza sul cambiamento di conformazione della proteina. 10. Rappresentante Risultati Etichettatura residui di cisteina extracellulare con fluorofori specifici permette l'indagine del movimento delle proteine ​​di membrana su cambiamenti conformazionali. Una tipica fascetta traccia di tensione fluorometria è mostrata in Figura 1. La variazione della intensità di fluorescenza (in basso a traccia), che è il movimento del fluoroforo da una più idrofila di più l'ambiente idrofobo o da una tempra in acqua di più per l'ambiente meno acqua di spegnimento, i risultati di un cambiamento conformazionale della proteina sulla soluzione di cambio (in alto traccia). Questa tecnica può essere extenciso di stabilire vincoli di distanza tra i due residui. Tali risultati sperimentali sono mostrati nella Figura 2. In presenza di un flurophore accettore (rosso), photobleaching avviene ad una velocità più lenta senza un fluoroforo accettore (nero). Il tasso di photobleaching è direttamente correlato alla distanza tra due fluorofori secondo l'equazione di Förster 17. Tali risultati possono essere correlati a diversi stati conformazionali della proteina, come verificato da due esperimenti di tensione elettrodo clamp eseguite in tandem. Figura 1. Registrare Rappresentante del trasporto di ioni e cambiamenti di intensità di fluorescenza. Top, misurazioni con la pinza di corrente in presenza di prova soluzione Na + e K + soluzione in esame in presenza di 10 mM e 10 mM ouabain. Fondo, i cambiamenti di intensità di fluorescenza misurata in tandem con misurazioni con la pinza di corrente 3,8,19. Figura 2. Dipendenza dal tempo della photobleaching. Fotodistruzione donatore viene misurata in assenza (nero) e la presenza di fluoroforo accettore (rosso). Ogni traccia è la media di 4 registrazioni degli ovociti.