המצאה של המכשיר microfluidic עבור מידור של Neuron סומה האקסונים

חלק 1: הכנת התקן נוירון microfluidic 3 "פרוסות סיליקון עם דפוס עשוי SU-8 על ידי photolithography משמש להטיל את התבנית (PDMS) polydimethylsiloxane microfluidic. אנו מתייחסים רקיק SU-8 תבניות סיליקון בדוגמת כמו הורים, או" מאסטרים ". PDMS מעורבב עם סוכן ריפוי ביחס aw / w של 10:01, כלומר, עבור 10 גרם של PDMS, 1 גרם של סוכן ריפוי מתווסף אליו. PDMS הוא מעורב אז גם ושפך על גבי פרוסות סיליקון. פרוסות סיליקון הכלול בתוך צלחת פטרי 10 ס"מ קלקר. זה לוקח בערך 12 גרם עד 15 גרם של PDMS לכיסוי הורים עם עובי של כ 4 מ"מ. האדון עם PDMS ממוקם אז dessicator ואקום עם מכסה את צלחת פטרי, ואקום מוחל. זה נעשה כדי לסייע להסיר בועות אוויר מן PDMS שהוצגו במהלך תזוזה של הסוכן ריפוי. זה לוקח בערך 15 דקות את בועות האוויר כדי להסירו. האדון עם PDMS יוסר dessicator. אקדח אוויר עם מסנן 0.45 אממ משמש כדי להסיר בועות הנותרים. אמן ממוקם אז על צלחת 80 מעלות צלזיוס חם במשך שעה 1 כדי לרפא. הערה: אם dessicator ואקום אינו זמין, האב ניתן להשאיר בטמפרטורת החדר במשך כמה שעות. בועות אוויר בסופו של דבר להפיג בכוחות עצמם. אם צלחת חמה אינו זמין, PDMS ירפא בטמפרטורת החדר לאחר 24 שעות. הערה: חשוב גם לוודא כי האדון הוא ברמה במהלך תהליך ריפוי. חלק 2: לחתוך את המכשיר microfluidic נוירון ברגע PDMS נרפא הבסיס, הוא נלקח אל מכסה המנוע נקי. שימוש בלהב כירורגי, עיגול הוא חתך מסביב המכשירים. כשאדם מכניס את הלהב לתוך PDMS, חשוב ליצור קשר עם פרוסות סיליקון, אבל לא לשים יותר מדי לחץ על פרוסות סיליקון, אחר המאסטר ייסדק. עם עיגול לחתוך את כל הדרך סביב המכשירים (יש 4 מכשירים לכל אחד מאסטר 3 הסיליקון "), PDMS הוא הרים בזהירות את המאסטר. זה יכול להיות נכתבו על ידי מסובב בעדינות את להב כירורגי כפי שהוא מוכנס לתוך לחתוך לפני . בשלב הבא, הם מאגרים אגרוף לתוך המכשיר באמצעות רקמות 8 מ"מ ביופסיה. התקנים הם לרבעים ואז PDMS עודף גזוז משם כך שהמכשיר יתאים בצורה מסודרת על כיסוי הזכוכית קורנינג (מס '1) 24 מ"מ x 40 מ"מ. חנקן באוויר משמש לסלק כל פסולת עודף. פסולת עיקש ניתן גם להסיר באמצעות 3M סקוטש 471 ברנד סרט ויניל. חלק 3: פלזמה מליטה התקנים תלושי כיסוי זכוכית. מנקה פלזמה משמש האג"ח Harrick המכשירים נוירון את תלושי לכסות. בקצרה, המכשירים מוצבים שואב פלזמה משאבת ואקום משמש לפנות אוויר החדר. אחרי הלחץ ואקום הגיע 300 milliTorr, כוח מופעל על סליל חשמלי מוגדר גבוה. סליל חשמלי יוצר פלזמה "גז מיונן חלקית בהיקף של אלקטרונים, יונים או מולקולות אטומים נייטרלים" – http://www.harrickplasma.com/plasma_physics.php , מתוך מולקולות האוויר הנותר נשאר בחדר. פלזמה יוצר מינים תגובתי על פני השטח של הזכוכית את המכשיר, אשר כאשר מציבים יחד יהוו קשר קבוע. פלזמה גם הופך את משטחי הידרופילי, אשר מסייע להקל על תוספת של נוזלים. בנוסף, מנקה פלזמה sterilizes המכשירים. פני השטח של המכשיר PDMS המכיל את המכשיר microfluidic ממוקם עם הפנים כלפי מעלה לתוך שואב פלזמה יחד עם שקופיות הזכוכית. משטחים פלזמה טיפול של הזכוכית המכשיר microfluidic הם התאספו על קשר אחד עם השני על ספסל נקי, הניח אז 60 מנות סטרילי מ"מ. משטחים מטופלים ליצור קשר הדוק בלתי הפיך. בתוך 10 דקות של פלזמה מליטה התקנים זכוכית, פולי-L-ליזין (PLL) מתווסף אל המכשיר. לאחר 10 דקות, hydrophilicity של המכשיר יקטין שהקשה על PLL כדי להזין את המכשיר. הערה: חשוב לבדוק את בועות האוויר במכשיר לאחר תוספת של PLL. בועות האוויר בערוץ העיקריים הם רצויים, כפי שהם היו התאים לחמצן. שיטה קלה להסיר כל בועות האוויר הקיימות היא להשתמש pipet P200 מלא ul 150 של הנוזל (במקרה זה PLL), הצב את קצה ישירות בפתיחת הערוץ הראשי, לדכא בכוח P200. זה עלול צורך לחזור כמה פעמים אבל בסופו של דבר את הכוח מן pipet יניעו את הבועות החוצה. המכשירים המכיל PLL מותר דגירה לילה בתרבות תקן רקמות החממה ב 37 ° C עם 5% CO 2. למחרת, דההחטאים הם שטפה פעמיים במהירות עם dH2O autoclaved. במהלך תהליך זה, נוזל לא יוסר לחלוטין מן הערוצים העיקריים, רק מתוך המאגרים. הסרת נוזל מן הערוצים העיקריים יציג בועות. אחרי 2 שטיפות מהיר, התקנים הם מלאים dH2O autoclaved והניח בחזרה מינימום של 3 שעות לתוך האינקובטור, או לילה. למחרת, התקנים הם שטפה שוב 2 פעמים מהר עם dH2O autoclaved. ואז, מדיה הבסיס העצבי, המכיל את התוספים הדרושים B27 ו glutamax עבור נוירונים culturing העיקרי עכברוש, הוא הוסיף את המכשירים. המכשירים מוצבים בחזרה לשימוש עתידי בחממה. המכשירים נמצאים כעת לקראת זריעה של נוירונים.