Time-lapse Live avbildning av kloner som är närbesläktade neurala stamceller i utvecklingsländerna Zebrafish framhjärnan
Summary
Den nuvarande videon demonstrerar en metod som drar nytta av kombinationen av elektroporation och konfokalmikroskopi att utföra Bildproduktion på enskilda neurala stamceller i utvecklingsländerna zebrafisk framhjärnan.<em> In vivo</em> Analys av utvecklingen av framhjärnan neurala stamceller till en klonal nivå kan uppnås på detta sätt.
Abstract
Exakt mönster av splittring, migration och differentiering av neurala stamceller är avgörande för korrekt hjärnans utveckling och funktion 1,2. För att förstå beteendet hos neurala stamceller i komplex in vivo miljö är tidsförlopp leva avbildning av neurala stamceller i en intakt hjärna kritiskt krävs. I denna video, utnyttja vi de unika egenskaperna hos zebrafisk embryon för att visualisera utvecklingen av framhjärnan neurala stamceller in vivo. Vi använder elektroporation till genetiskt och glest etikett enskilda neurala stamceller. Kortfattat bygger DNA som kodar för fluorescerande markörer var injiceras i framhjärnan kammare 22 timmar efter befruktning (HPF) zebrafisk embryon och elektriska pulser levererades omedelbart. Sex timmar senare var electroporated zebrafisk embryon monteras med låg smältpunkt agaros i glas rätter botten kultur. Fluorescerande neurala stamceller har sedan avbildade för 36hours med jämna mellanrum under ett konfokalmikroskop med vatten att doppa objektiv. Denna metod ger ett sätt att få insikt i in vivo utvecklingen av framhjärnan neurala stamceller och kan tillämpas på andra delar av centrala nervsystemet i zebrafisk embryot.
Protocol
Discussion
I denna video visar vi en metod för tidsförlopp leva avbildning av neurala stamceller till en klonal nivå i utvecklingsländerna zebrafisk framhjärnan. Vi testade och ändrade den befintliga elektroporation protokollen 4-6 till genetiskt och fluorescerande etikett enskilda neurala stamceller. En härstamning träd består av kloner relaterade avkomma celler kan fastställas eftersom endast ett fåtal celler var glest märkt med en relativt låg spänning på elektroporation. Förutom EGFP kan neurala stam…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av theNIH grantNS042626. Vi tackar Kurt Thorn och UCSF Nikon Imaging centrum för hjälp med bildbehandling.
References
- Temple, S. The development of neural stem cells. Nature. 414, 112-117 (2001).
- G#246;tz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 777-788 (2005).
- Cerda, G. A., Thomas, J. E., Allende, M. L., Karlstrom, R. O., Palma, V. Electroporation of DNA, RNA, and morpholinos into zebrafish embryos. Methods. 39, 207-211 (2006).
- Hendricks, M., Jesuthasan, S. Electroporation-based methods for in vivo, whole mount and primary culture analysis of zebrafish brain development. Neural. Dev. 2, 6-6 (2007).
- Tawk, M., Bianco, I. H., Clarke, J. D. Focal electroporation in zebrafish embryos and larvae. Methods Mol. Biol. 546, 145-151 (2009).
- Tawk, M., Tuil, D., Torrente, Y., Vriz, S., Paulin, D. High-efficiency gene transfer into adult fish: a new tool to study fin regeneration. Genesis. 32, 27-31 (2002).
