Détection des modifications post-traductionnelles sur les autochtones nucléosomes Intact par ELISA

1. Culture de cellules mammaliennes NU-ELISA peut être effectuée sur n'importe quel type de cellules de mammifères qui peuvent être mises en culture. Nous préférons pour préparer modéré à d'importants lots de cellules de sorte que les nucléosomes peuvent être isolés en quantité suffisante pour préparer plusieurs identique chargés plaques ELISA, permettant ainsi des tests avec plusieurs anticorps différents (Abs). Les échelles de culture suivants fournissent un abondant matériel: Pour les cellules de souris tige embyronic, pousser un ou deux plaques 15 cm de cellules sans cellules nourricières. Pour les fibroblastes, croissance de 5 à 10 15 cm à plaques confluent. 2. Isolement des noyaux Remarque: Toutes les étapes sont sur la glace avec pré-réfrigérée tampons, sauf comme indiqué. Trypsiniser cellules avec 3 ml de trypsine par assiette, mélanger, et ajouter 20 ml de PBS glacé / butyrate. Centrifuger à 1000 rpm pendant 5 min. Resuspendre les cellules dans 10 ml de PBS / butyrate et centrifuger à 1000 rpm pendant 5 min. Remettre en suspension dans 4 ml avec un tampon de lyse inhibiteurs de la protéase (Sigma-Aldrich P-8340). Dounce homogénéiser les 20 coups de pilon de type B sur la glace. Centrifuger à 2000g pendant 10 min à 4 ° C. (Le surnageant contient cytoplasme, ce qui n'est pas nécessaire pour ce protocole, mais il peut être sauvegardé pour d'autres usages si désiré). Reprendre le culot dans 2 ml de glace froide tampon de lavage C (avec des inhibiteurs de la protéase). Couche le matériel remis en suspension de plus de 5 ml coussin de saccharose à 30%, puis centrifuger à 2400g pendant 5 min dans un rotor swing. Les noyaux vont migrer à travers coussin, et les débris restent à l'interface. Retirez tout le volume de liquide soigneusement et remettre en suspension les noyaux de glace de 250 tampons de lavage à froid ul C + inhibiteurs de protéase. 3. Isolement des nucléosomes in situ par des Micrococcal nucléase (MNase) Digestion Nous utilisons une procédure dans laquelle la chromatine est digérée in situ au sein des noyaux en leur insufflant MNase, suivie d'un traitement hypotonique à conduire sans nucléosomes intacte dans le surnageant. Ajouter 3 pi à 0,1 M CaCl 2 à l'échantillon. Mettre en bloc de 37 ° C chaleur. Permettez à assumer 37 ° C de température. Ajouter 2 unités MNase (Micrococcal nucléase, Sigma-Aldrich, dissous à 2 dans un tampon de units/10μl MNase), puis incuber pendant à 37 ° C pendant 12 minutes, en mélangeant souvent avec une pointe de pipette. Ajouter 6 ul de 0,5 M Na-EDTA, pH 8,0 pour arrêter la réaction. Mis sur la glace. Centrifuger à 2000g pendant 4 min, éliminer le surnageant. Reprendre le culot dans 300 pl 0,2 mM Na-EDTA. Store sur la glace pendant 1 h avec pipetage doux occasionnels. (Ces conditions hypotoniques libérer nucléosomes libres de noyaux). Centrifuger à 3000 g pendant 4 min à 4 ° C. Enregistrer le surnageant, qui contient des nucléosomes libres, sur la glace. Reprendre le culot à nouveau avec 300 pl 0,2 mM Na-EDTA. Store sur la glace pendant 1 h avec pipetage doux occasionnels. Centrifuger à 3000g pour 4min à 4 ° C. Conservez le surnageant et de combiner avec le premier surnageant de l'étape 5. Les préparatifs résultant mononucleosome peut être aliquotés et conservés à -80 ° C. Remarque: Le montant de la chromatine peuvent être grossièrement quantifiée en mesurant l'absorbance à 260 nm d'un échantillon de 10 ul ajouté à 990 pl d'eau. A 260 = 10 (après ajustement pour la dilution 1 / 100) correspond à environ 1mg/ml de la chromatine. En outre, durant la procédure ci-dessus, de petits échantillons peuvent être conservés et, plus tard analysés pour leur contenu en ADN pour contrôler la qualité et l'étendue des digestions MNase, qui devrait surtout contenir de l'ADN de 146 pb de longueur. L'échelonnement est indicatif de la digestion MNase incomplète. Remarque: Fig.1 contient un résumé schématisés d'isolement nucléaire et les digestions MNase étapes. 4. Nucléosome-ELISA (NU-ELISA) Nous détectons PTM sur les fractions contenant des espèces autochtones nuclesosomes intacts qui ont été immobilisés sur des plaques de microtitration de 96 puits ELISA. Pour chaque échantillon, nous faisons une série de deux dilutions, et elles sont appliquées sur des puits en triple exemplaire. Déposer sur des plaques MaxiSorp nuit à 4 ° C avec 50 ul / puits de nucléosomes dilués dans un tampon de revêtement. Suggestions de dilutions en série de nucléosomes sont préparés à partir de rangée du haut de la rangée du bas en ajoutant 0,1 mg, 0,05 mg, 0,025 mg, 0,0125 g, 0,00625 mg, 0,00313 mg, 0,00156 mg, avec le tampon seul revêtement (0 chromatine mg) dans le fond rangée. (Note: couvre la plaque sont nécessaires pour cette étape.) Dans la matinée, se laver les plaques 4 fois avec 200 pl / puits PBS/0.5% Tween-20 à température ambiante (TA) pour un total combiné de 10 min avec un laveur de plaques. Bloc 1 h à température ambiante avec 100 ul / puits PBS/0.05% de Tween-20 / 5% de BSA. Retirez le tampon de blocage en secouant la plaque inversée brusquementdessus d'un évier. Couvrez et conservez les plaques à -20 ° C, ou aller directement à l'étape suivante. Ajouter 1 ° Abs dans un volume de 50 pl / puits dilué 1:1000 (ou au besoin) dans PBS/0.05% de Tween-20 / 5% de BSA, incuber à température ambiante pendant 1 heure sur un agitateur. Laver les plaques 4 fois avec 200 pl / puits PBS/0.5% Tween-20 à température ambiante et pour un total combiné de 10 min dans un laveur de plaques. Ajouter la peroxydase de raifort (HRP) conjuguée à 2 ° Abs, dilué 1:5000 (ou au besoin) dans PBS/0.05% de Tween-20 / 5% de BSA à température ambiante pendant une heure sur un agitateur. Laver les plaques 4 fois avec 200 pl / puits PBS/0.5% de Tween-20. Chaque lavage est à température ambiante et pour un total de 10 minutes avec un laveur de plaques. Développer les plaques en ajoutant 50 pl de substrat TMB dans chaque puits pendant 10 min à température ambiante. Arrêter la réaction en ajoutant 50 pl / puits de 2N H 2 SO 4 et de lire les plaques de 450 nm. (Astuce: Centrifuger à 1500 rpm pendant 2 min à l'aide d'un rotor plaque à dissiper les bulles d'air dans le puits avant la lecture absorbances). Exporter les lectures de fichiers tableur pour des analyses quantitatives et statistiques. Réactifs PBS / butyrate 135 mM de NaCl 2,5 mM de KCl 8 mM Na 2 HPO 4 1,5 mM KH 2 PO 4 10 mM de Na-butyrate Lysis Buffer 250 mM de saccharose 10 mM Tris-HCl, pH 7,4 10 mM de Na-butyrate 4 mM de MgCl2 0,1% de Triton X-100 Laver le tampon C 250 mM de saccharose 10 mM Tris-HCl, pH 7,4 10 mM de Na-butyrate 4 mM de MgCl2 Coussin de saccharose 30% (p / v) de saccharose dans le tampon de lavage C Microccocal nucléase Tampon 5 mM NaPO 4 tampon, pH 7,0 0,025 mM CaCl 2 Tampon de revêtement Solution 80ml 170ml Solution A + B + 250ml dH 2 O Solution A: 0,2 M Na 2 CO 3 Solution B: 0,2 M de NaHCO 3 5. Les résultats représentatifs En utilisant la méthode ELISA-NU, une série de plusieurs plaques identiques sont préparés qui peuvent être chargés avec la chromatine préparées sous la forme d'mononucleosomes. Nous préparent habituellement série de plaques à l'identique-chargés afin que chacun peut être sondé avec différents anti-PTM anticorps spécifiques (Abs). Nous avons également toujours préparer une plaque qui peut être sondé avec un Ab qui détecte les histones, sans égard à leur état de modification de chargement chromatine contrôle total. Ce contrôle est indispensable pour pouvoir ensuite comparer quantitativement le contenu du PTM nucléosomes préparés à partir d'échantillons différents. Pour quantifier les niveaux de PTM dans un échantillon donné, nous chromatine corriger les valeurs d'absorbance brutes en utilisant cette approche: d'abord, nous soustrayons tout signal de fond en utilisant les valeurs obtenues à partir de puits de contrôle ne contenant pas de chromatine (fond est généralement négligeable). Nous avons ensuite normaliser PTM signaux spécifiques aux NU-ELISA résultats obtenus à partir d'une plaque identique chargé qui a été dosé avec un Ab qui détecte nucléosomes indépendamment de leur état de modification. (Nous avons utilisé des anticorps polyclonaux dirigés spécifiques des histones H2A ou H2B à cet effet). Nous avons ensuite déterminer les moyens et les écarts pour chaque dilution de la chromatine, et utiliser les données obtenues à partir de la portion linéaire du test ELISA. Des exemples détaillés de NU-ELISA analyses mathématiques et statistiques ont été rapportés précédemment 4 Figure 1. Schéma Diagam des NU-ELISA étapes. A. Cellules mammifères sont récoltés; Noyaux B. sont séparés de cellules par Dounce homogenization, C. Perturbation cellules sont chargées sur le dessus d'un coussin de saccharose p / v 30%, D. Après centrifugation, les noyaux sont déposés dans le culot; E, F. chromatine sont digérées in situ à prédominance mononucleomes par MNase; G, H , je. mononucleosomes solubles sont extraites par un traitement hypotonique et centrifugation répétée de matières nucléaires résiduelles. Mononucleosomes juge à partir d'échantillons différents (SAMP étiquetés. 1 et 2 dans ce cas) sont enduits sur des puits de microtitration en série de manière identique-chargé avec des plaques et interrogé Le PTM-spécifiques Abs et PTM-Abs indépendante pour déterminer le chargement chromatine totale. Représentation des niveaux K. signal différentiel de détection dans deux échantillons qui diffèrent dans leur contenu PTM, mais ont les mêmes contenus chromatine globale, à en juger par les anti-H2B immunoréactivité.