离体骨骼肌肌的力学分析
1Cardiovascular Research Institute,University of California San Francisco, 2Department of Pediatrics,University of California San Francisco, 3Department of Biology,San Francisco State University, 4Department of Medicine,University of California San Francisco , 5Eli and Edythe Broad Center of Regeneration Medicine & Stem Cell Research,University of California San Francisco
Summary
为了评估<em>在体内</em>肌肉疾病的治疗性干预的影响，方法是需要定量力量的产生和治疗肌肉疲劳性。我们详细评估explanted小鼠后肢肌肉的肌力学性能的方法。这种分析提供了一个强大的方法，以定量的影响肌肉功能的基因改造，以及在治疗肌肉疾病的小鼠模型的比较。
Abstract
在体内治疗肌肉疾病1,2,3的治疗干预的影响评估，定量分析方法，测量力的产生和治疗肌肉疲劳性。我们描述了一个新鲜explanted从小鼠后肢肌肉中的肌机械性能评估的详细方法。我们描述了小鼠趾长伸肌肌肉的非创伤性的收获，安装的肌肉，在肌肉地带肌动描记器（型号820MS;丹麦MYO技术）和最大抽搐，强直张力，收缩时间，半弛豫时间的测量，使用方波脉冲刺激器（型号S48;草技术）。使用这些测量，我们展示了具体的抽搐和规范化肌肉的横截面积，抽搐，强直紧张的比例，力-频率关系曲线和低频疲劳曲线 4强直张力的计算。这种分析方法提供了一个为1,2,3,5肌肉疾病的小鼠模型，以及治疗干预的肌肉功能的基因改造6,7,8,9影响比较之间的定量比较。
Protocol
加州大学旧金山分校的机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准该协议。 1。鼠标趾长伸肌 （EDL）肌肉的解剖按照机构准则执行的所有动物的程序。 安乐死与200 mg / kg腹腔巴比妥/颈椎脱位，肌肉收获10前的动物。剥离应实行，使肌肉可收获和“安乐死”的15分钟内，安装在张力换能器。 夹层纸盒和引脚腿到托盘上排列胴体仰卧。 在解剖镜下，开放的皮肤，小心地打开筋膜（图1a），和剥离胫骨从脚踝向上暴露的EDL（图1b） 。使用滴乳酸林格氏液，以保持肌肉湿润和收获期间的缓冲。 删除的EDL，保留尽可能多的肌腱上，每年年底，并把到一个Petri菜含有乳酸林格氏液。铁缝合肌腱（ 图1c）。重要的是，肌纤维不能触及，或在清扫不安。 2。鼠标EDL的安装在肌肉地带肌动描记对于这些研究中，一个组织洗澡是需要的，固定的肌肉，同时允许它在恒温沐浴在生理溶液中连续充氧。洗澡加上一个力传感器的测量肌肉紧张。我们采用从丹麦MYO技术（DMT型号820MS）的综合肌肉地带肌动描记洗澡为此。此外，一个方形脉冲电刺激（草型号S48）和数据采集平台（ADInstruments PowerLab系统的数据采集系统和LabChart软件）引出，记录和分析MYO机械的反应，分别需要。大唐820MS集成到盒盖定位肌肉两侧肌肉地带中旬部分，铂电极。其他myographs可能需要特别注意电极放置。 肌动描记浴填写5毫升克雷布斯Henseleit解决方案11。加热至25 ° C。泡泡O 2 / CO 2（95％/ 5％），通过洗澡前15分钟使用。 使用缝线的EDL肌动描记夹具之间的延长和夹具之间的EDL肌筋（Fig.1D五 ）安全。要小心不要夹肌肉本身。 肌动描记浴保持在25 ° C。 3。肌的力学分析 A.抽搐紧张在洗澡时设置的初始长度，以便有没有肌肉松弛。 确定通过调整电压，以获得最大的抽搐紧张的最大刺激（持续时间为0.5毫秒），然后设定在20％以上最大的刺激（实现超最大刺激）。在我们的研究，超最大的刺激，通常在40伏的输出实现。 验证从使用示波器的刺激输出。 确定最佳长度逐渐伸展的肌肉，直到没有抽搐的紧张局势进一步增加。 允许3分钟的肌肉平衡。 交付平方米超最大的刺激在最佳使用电子刺激S44草的长度（0.5毫秒），并记录输出。 记录：抽搐张力曲线（P T随时间; 图2A）。 B.破伤风紧张让肌肉休息3分钟。 应用最佳使用电子刺激S44草的长度在150赫兹的超最大刺激的列车为300毫秒，并记录输出。 记录：破伤风张力曲线（P O随时间; 图2B）。 C.部队频率让肌肉休息3分钟。 部队频率：适用于30，60，100，140和160赫兹的超最大刺激的列车，彼此之间的刺激（图3）休息3分钟。此外，火车可应用于15，25，35，45，55，65，75，100，140和160赫兹在较低的频率更高的分辨率，其中力变化显着。 剧情：力频率的关系（％最大力量与刺激频率）。 D.疲劳应用短破伤风的火车：300毫秒（或调整，以产生50％的峰值力的频率），每10分钟3秒60赫兹。 10分钟，强直力下降的一个〜15％的初始值（ 图4）高原水平。 剧情：低频疲劳（％最大力量与时间）。 E.在协议结束额外的数据收集在卸载肌肉的肌动描记之前，设置MUSC乐在最佳长度确定的步骤III.A.4，使用显微镜或一个眼，用游标卡尺测量其直径。计算截面积（2微米）。 通过去除缝线，体重肌肉测量肌肉质量（毫克）。 称重鼠标评估体重（GM）。 4。计算肌肉：体重比= 肌肉质量/体质量抽搐紧张，P T（MN）= 在抽搐产生的最大张力具体抽搐张力（N /厘米2）= 抽搐张力（MN）/截面积（2微米）× 10 5 / MN•微米2 /厘米2 到峰值张力时间（毫秒）= 从收缩发病时间最大张力半弛豫时间（毫秒）= 从峰值紧张到峰值张力的50％ 强直紧张，P O（MN）= 在破伤风产生的最大张力具体强直张力（N /厘米2）= 强直张力（MN）/截面积（2微米）× 10 5 / MN•微米2 /厘米2 破伤风上升最大速率（N / S）= 期间，破伤风，即紧张，强直张力曲线的最大斜率（或DP的O / DT）上升的紧张局势加剧的最高税率半松弛强直张力（MS）= 时间从停止刺激，在紧张刺激终止的50％ 抽搐紧张强直张力比，P – T / P O = 最大抽搐张力/最大强直张力疲劳指数= 经过两分钟的低频疲劳等长张力最大的张力比 5。代表性的成果 图1。剖析的EDL肌肉。 EDL的一个 muscles.TA，后肢胫前，B，EDL（趾长伸肌）肌曝光，曝光C，EDL的肌腱缝合的附件，D，张力传感器浴（从侧面看），E，安装在洗澡（从上面）。在肌肉未完全沉浸在缓冲区，仅供;在实践中，应完全沉浸肌肉，防止干燥。 图2。张力曲线的例子 。 的抽搐紧张说明抽搐最大张力（P T），收缩时间（CT）和半弛豫时间（HRT）的曲线，例如酒吧，1秒，B，强直张力曲线显示最大强直张力（P O）的例子，半松弛强直张力（HRTT）。酒吧，1S。 图3。力频率的关系分析的例子 。 ，增量刺激频率产生的紧张局势，B，例如，在30MHz的脉冲序列。酒吧，80毫秒，C，例如，在140MHz的脉冲序列。酒吧，80毫秒，D，从A 中显示的数据派生的力-频率曲线的例子。力 – 频率曲线的形状是肌肉力量的特点，可以比较来自不同动物的肌肉之间。 图4。低频疲劳分析的例子 。超过stimulation.Examples在指定的时间点（B，C，D）的低频脉冲串期间产生了递减的紧张局势图所示，E，从 A中显示的数据产生的低频疲劳曲线的范例。低频疲劳曲线的形状是肌肉力量的特点，可以比较来自不同动物的肌肉之间。
Discussion
我们描述了一个详细的评估，在explanted从小鼠后肢肌肉的肌机械性能的方法。 EDL的，而更难以解剖，因为其背后的胫前肌后的位置，比胫前，因为其突出的腱附件的脚踝和膝盖关节更容易评估。这些筋便于安装在肌肉地带肌动描记。相反，更容易访问的胫前在膝关节广泛，几乎atendinous附件，异常艰难的两个剖析不影响肌肉的前提下，并安装在肌动描记安全。我们还指出，迅速安装在生理缓冲液和温度中的含氧浴肌肉，保持肌肉的力学性能是必不可少的。我们发现，我们可以长达30分钟重复这种分析没有显着变化，在这种条件下肌肉反应。最后，它是必不可少的，肌纤维不被感动在解剖和安装程序，可以有肌肉功能上的不利影响，并导致低估肌机械力。遵循这些程序，这种分析提供了可靠的定量方法来评估的肌肉功能的基因改造6,7,8,9影响，以及在肌肉疾病的小鼠模型1,2,3,5治疗性干预之间的比较。
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是支持公共卫生服务津贴（HL086513）从NHLBI私立教育机构，以及来自加州再生医学（RC1 – 00104），公共卫生服务津贴（HL085377）从NHLBI研究所的综合研究资助和礼品波林基金会HSB
资深大律师是一个加州再生医学的桥梁研究所的支持干细胞研究奖（TB1 – 01194）旧金山州立大学。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
| 5-0 silk sutures | Oasis | MV682 | General surgery | |
| Dupont #5 forceps | WPI | 500233 | General surgery | |
| Hemostat, straight | WPI | 501241 | General surgery | |
| Iris forceps | WPI | 15914 | General surgery | |
| Lab Chart software | ADInstruments | Version 7 | Data analysis | |
| Muscle Strip Myograph | DMT | 820MS | Tension transduction | |
| Operating scissors | WPI | 501754 | General surgery | |
| Oscilloscope | EZ | OS-5020 | Tension stimulation | |
| Pentobarbital, sodium salt | Sigma | P3761 | Euthanasia | |
| PowerLab | ADInstruments | 8/30 | Data acquisition | |
| Square Pulse Stimulator | Grass Tech. | S48 | Tension stimulation | |
| Vannas spring scissors | WPI | 14003 | General surgery |
Solutions and Media
Lactated Ringer’s solution
- 100 mM NaCl
- 30 mM CH3CH(OH)COONa (sodium lactate)
- 4 mM KCl
- 1 mM CaCl2 2H2O (calcium chloride dihydrate)
- adjust pH to 6.75
Krebs Henseleit solution
- 118 mM NaCl
- 4.7 mM KCl
- 1.25 mM CaCl2
- 1.2 mM MgCl2
- 1.2 mM KH2PO4
- 25 mM NaHCO3
- 11 mM glucose
- adjust pH to 7.2-7.4 by equilibrating with O2/CO2 (95%/5%) gas
Pentobarbital
- 5 mg/ mL working solution in sterile water
References
- Harcourt, L. J., Schertzer, J. D., Ryall, J. G., Lynch, G. S. Low dose formoterol administration improves muscle function in dystrophic mdx mice without increasing fatigue. Neuromuscul Disord. 17, 47-55 (2007).
- Messina, S. VEGF overexpression via adeno-associated virus gene transfer promotes skeletal muscle regeneration and enhances muscle function in mdx mice. FASEB J. 21, 3737-3746 (2007).
- Danieli-Betto, D. Sphingosine 1-phosphate protects mouse extensor digitorum longus skeletal muscle during fatigue. Am J Physiol Cell Physiol. 288, C1367-C1373 (2005).
- MacIntosh, B. R., Willis, J. C. Force-frequency relationship and potentiation in mammalian skeletal muscle. J Appl Physiol. 88, 2088-2096 (2000).
- Hayes, A., Williams, D. A. Contractile properties of clenbuterol-treated mdx muscle are enhanced by low-intensity swimming. J Appl Physiol. 82, 435-439 (1997).
- Coulton, G. R., Curtin, N. A., Morgan, J. E., Partridge, T. A. The mdx mouse skeletal muscle myopathy: II. Contractile properties. Neuropathol Appl Neurobiol. 14, 299-314 (1988).
- Danieli-Betto, D. Deficiency of alpha-sarcoglycan differently affects fast- and slow-twitch skeletal muscles. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 289, R1328-R1337 (2005).
- Chan, S. A gene for speed: contractile properties of isolated whole EDL muscle from an alpha-actinin-3 knockout mouse. Am J Physiol Cell Physiol. 295, C897-C904 (2008).
- Personius, K. E. Grip force, EDL contractile properties, and voluntary wheel running after postdevelopmental myostatin depletion in mice. J Appl. , (2010).
- Donovan, J., Brown, P. Euthanasia. Curr Protoc Immunol. Chap 1, (2006).
- Beekley, M. D., Wetzel, P., Kubis, P., Gros, G. Contractile properties of skeletal muscle fibre bundles from mice deficient in carbonic anhydrase II. Pflugers Arch. 452, 453-463 (2006).
Tags
Myo-mechanical AnalysisIsolated Skeletal MuscleTherapeutic InterventionsMuscle DiseaseQuantitative MethodsForce GenerationFatigabilityHindlimb MuscleExplanted MuscleMuscle Strip MyographMaximal Twitch TensionTetanic TensionContraction TimeHalf-relaxation TimeSquare Pulse StimulatorSpecific Twitch TensionSpecific Tetanic TensionMuscle Cross-sectional AreaTwitch-to-tetanic Tension RatioForce-frequency Relationship CurveLow Frequency Fatigue CurveComparison Between Therapeutic InterventionsMouse Models Of Muscle DiseaseGenetic ModificationMuscle Function
Citer Cet Article
Oishi, P. E., Cholsiripunlert, S., Gong, W., Baker, A. J., Bernstein, H. S. Myo-mechanical Analysis of Isolated Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (48), e2582, doi:10.3791/2582 (2011).