성인에서 태어난 뉴런의 통합을 공부

1. 바이러스 사출 높은 titer 공학 레트로 바이러스 (1 × 10 9 단위 / ML) retroviral 벡터의 공동 transfection에 의해 생산 및 바이러스 뜨는의 ultracentrifugation 다음 HEK293T 세포로 VSVG입니다. 소스 및 생산 방법에 대한, 우수한 조브 데모 (3)을 참조하십시오. 참고 : 젊은 성인 (4-6 주를 넘어서는 안 됨) 여성 C57Bl / 6 생쥐 (찰스 리버)가 표준 조건 하에서 보관되어 있습니다. 모든 절차는 스토니 브룩 대학 IACUC 승인 프로토콜에 따라 실험실 동물 관리 및 사용을위한 국립 연구위원회의 안내를 따르십시오. 얼음 동물 당 냉동 레트로 바이러스의 해동의 2ul. 마취시키다 (100 μg의 마취제 + g 체중 당 10 μg의 xylazine)하고 stereotaxic 프레임 (Steolting)에 동물을 탑재합니다. 머리에 머리를 제거하고 70 % 에탄올로 피부를 닦아냅니다. 두개골을 노출 다음과 같은 지점에서 치과 드릴 (0.6mm 드릴 비트)를 사용하여 네 얕은 구멍을 드릴 : anterioposterior bregma에서 = -2 mm, 측면 = ± 1.6 mm, 복부 = 2.5 mm; anterioposterior bregma에서 = -3 mm, 측면 = ± 2.6 mm, 복부 = 3.2 mm. anterioposterior bregma에서 = -2 mm, 측면 = ± 1.6 mm, 복부 = 2.5 mm; anterioposterior bregma에서 = -3 mm, 측면 = ± 2.6 mm, 복부 = 3.2 mm. 1μl 해밀턴, 평면 팁 주사기를 탑재하고 이가있는 이랑에 0.25 μl / 분 속도로 사이트마다 0.5 μl 역 바이러스를 주입. 천천히 유체 역류를 방지하기 위해 주사기를 철수하기 전에 각 주입 후 (복부 깊이에 대한 위의 좌표를 참조하십시오.) 일시 정지 2 분. 주사 사이에, 간략하게 멸균 PBS로 주사기 팁 및 혈액 성분을 제거하는 작은 주걱의 외부 표면을 씻어. 무균 수술 봉합 재료와 상처 (타입 P – 1; 크기 6-0)을 닫고 사출 후 원하는 시간 단계까지 표준 주택 조건으로 동물을 반환합니다. 2. 슬라이스 준비 성인 생쥐에서 고품질의 급성 조각을 얻으려면, 우리는 (아래 참조) 슬라이스 준비를위한 수정 가공 솔루션을 사용합니다. 0-4 ° 95%와 얼음과 거품에 C O 2 -5 % 적어도 30 분 동안 CO 2 사전 진정 절단 솔루션입니다. 마취시키다 및 transcardially 얼음처럼 차가운 산소 포화 절삭 솔루션 동물 perfuse. 신속하게 필터 종이 감기, 산소 절단 솔루션으로 사전 침수와 배양 – 접시에 머리를 제거합니다. 소뇌로를 차단하고 (표시) 사출 좌표 최소 1mm의 앞쪽에 장착 표면 슬라이스. 접착제는 두뇌에 vibrotome 무대와 추위와 산소 절단 솔루션으로 가득 절삭 챔버로를 탑재합니다. 코로나 또는 수평 조각 (300 – 350μm)을 준비하고 룸 온도 ACSF을 포함하는 잠복기 챔버에 큰 구멍 피펫으로 그들을 전송는 95 % O 2 / 5% CO 2와 함께 부풀어 오른 모양이었다. 30~60분 32 ° C에서 슬라이스, 지속 버블링를 품어. 녹음 기간 동안 실내 온도에 챔버를 반환합니다. 3. Electrophysiological 실험 34 ° C. – 조각이 지속적으로 32 ° C에서 산소 포화 ACSF로 perfused있는 기록 챔버로 전송됩니다 바이폴라 텅스텐 자극 전극은 낮은 배율 현미경의 목표 (10X)를 사용하여 이가있는 이랑의 분자 층에 배치됩니다. 하위 세분화된 영역 / 세분화된 세포 계층의 신생아 DGCs는 GFP 또는 dTomato의 표현에 의해 식별됩니다. 전체 셀 patchclamp 녹음은 높은 배율 (40X)에서 신생아 뉴런에서 수행됩니다. 기록된 세포의 소성 특성 전류 클램프 모드에서 전류의 일련의 주입에 의해 얻을 수 있습니다. 전기 자극은 레코딩 소프트웨어에 의해 제어되는 자극의 아이 솔 레이터를 통해 자극 전극으로 전달하고, 기록하는 신생아 DGCs에서 postsynaptic 전류를 evoked있다. 4. 데이터 분석 evoked postsynaptic 응답 Amplitudes은 성인에서 태어난 뉴런의 다른 발달 단계에서 분석하고 있습니다. 5. 대표 결과 위의 프로토콜을 사용하여 그림 1과 비슷한 신생아 이가있는 이랑의 뉴런에 GFP 표현이 일반적입니다. 신생아 뉴런 쉽게 시각이며, 모두 dendrites과 axons가 견고하게 표시됩니다. 얇은 DGC axons 작은 쪽이 표현은 바이러스의 품질과 titer, 사용되는 모터와 생체내 표현의 길이에 따라 다릅니다. 우리 손에, 신생아 세포 하위 세포 organelles는 사출 다음과 같은 몇 일 이내 볼 수 있으며, 척추 표현은 개발의 초기 단계에서 추적할 수 있습니다. W다른 시간 단계에서 신생아 뉴런에서 구멍 세포 레코딩은 성숙 (그림 2B) 동안 기존의 신경 회로에 고유한 신생아 셀 속성, 예를 들어 행동 잠재력 (그림 2A),뿐만 아니라 시냅스 통합 과정의 연구를 수 있습니다. 성인 마우스의 수평 이가있는 이랑 섹션에서 신생아 뉴런의 그림 1은 2 광자 공촛점 이미지. 그린 세포가 21dpi 아르 (일 게시물 주입) GFP – 표현 pUX – GFP의 레트로 바이러스와 라벨 신생아 DGCs합니다. 그림 2) 액션 가능성 21 신생아 DGC의 속성을 발사 DPI. B)이 대표는 21 DPI에서 신생아 DGC에 기록된 흥분성의 postsynaptic 전류 (EPSCs)를 evoked.