Perles de séparation et les cellules dans des dispositifs microfluidiques multi-canal en utilisant diélectrophorèse et à flux laminaire

Un schéma général de la configuration de l'équipement est montré dans la figure 1A. L'assemblage PCB-échantillon est détaillée dans un schéma en coupe de la figure 1B. 1. Préparation des électrodes PCB: PCB Design électrodes à la géométrie désirée pour générer un champ électrique non uniforme. Personnalisé puces électrode PCB peuvent être commandés par des installations de fabrication commerciale (figure 1C). Préparer préfabriqués électrodes PCB par soudage de calibre 16 fil à la fin de chaque électrode métallique imprimé (figure 1D). Placez le fil à l'extrémité de l'électrode. Tenez le fil en place sur la partie métallique du PCB avec le fer à souder chaud pour chauffer le fil. Nourrir un peu de soudure sur le fil chauffé à remplir le fil avec de la soudure. Après le fil est rempli avec de la soudure, enlever le fer à souder, maintient le fil en place pendant la soudure se refroidit. Répétez le processus de soudage pour chaque raccordement électrique sur le PCB (figure 1D). 2. Préparer canaux microfluidiques: Polydiméthylsiloxane (PDMS) basé canaux microfluidiques sont préparés en utilisant l'élastomère PDMS, Sylgard 184 de Dow Corning. Un moule maître qui définit les canaux sont généralement créées par des procédés de microfabrication standard en utilisant une plaquette de silicium et de résine photosensible SU-8. Mélanger composé de base à l'agent de durcissement à un ratio de 10:1 pour 5 minutes. Verser le liquide PDMS sur le moule préfabriqué SU-8 maîtriser et éliminer les bulles d'air en exposant liquide PDMS au vide pendant quelques minutes. Répétez le processus si nécessaire sous vide pour éliminer complètement toutes les bulles. Guérissez les PDMS à 70 ° C pendant 2 heures. Retirez la dalle avec des canaux microfluidiques en PDMS de la plaquette avec une lame de rasoir, attention à ne pas casser la plaquette. Percez des trous pour l'introduction de liquides et de cellules dans le dispositif microfluidique. (Remarque: Seringue de pompage, gravité ou la tension superficielle de débit basée peuvent tous être utilisés avec DEP). Inspectez le dispositif microfluidique afin de s'assurer qu'elle est exempte de poussière et de débris. Nettoyage du PDMS peuvent facilement être réalisé en utilisant ruban 3M Scotch Magic. Plasma coller les canaux microfluidiques en PDMS à un nettoyage No.0 épaisseur (80 à 130 um) lamelle. Chauffer l'assemblage lamelle-microfluidique à 100 ° C pendant un minimum de 15 min. 3. Préparer les médias à faible conductivité-: Faible conductivité des médias est préparée en mélangeant 8,5% de saccharose glucose + 0,3% (p / v) dans déminéralisée (DI) d'eau 1. Remarque:. Nous avons déjà démontré que les cellules peuvent être cultivées pendant des jours dans les milieux de culture conventionnels cellule après avoir été exposés à une faible conductivité pour de courtes périodes (environ 30 min) 11 4. Assemblez canaux microfluidiques sur des électrodes du circuit imprimé: Placer une petite quantité (environ 10 pi) de l'huile minérale sur le PCB pour assurer un contact étroit entre le PCB et la lamelle. Remarque: Une étape facultative pour diminuer la visualisation de l'électrode est de recouvrir la surface PCB avec une très fine couche de feutre indélébile noir ou peinture. Placez l'ensemble de canal lamelle-microfluidique sur le PCB huilé, avec contact lamelle formant avec l'huile (lamelle vers le bas). Appuyez doucement sur l'assemblage lamelle-microfluidique vers le bas pour assurer un bon contact et de minimiser les bulles d'air qui peuvent nuire à la cellule et la visualisation de perles. Un exemple de dispositif complété est montré dans la figure 1D. 5. Trier et concentré Perles et Cellules utilisant DEP: Remplissez les canaux microfluidiques avec de l'eau DI ou à faible conductivité des médias, le processus de collage de plasma facilite le chargement facile des solutions aqueuses dans les canaux microfluidiques par temporairement rendant la surface hydrophobe normalement PDMS hydrophile. Introduire des cellules et / ou des billes de polystyrène dans le réservoir de canal (figure 1C). Ici, nous utilisons un adénocarcinome du côlon humain (HT-29) cellules. Connectez la sortie d'un générateur de fonctions à l'entrée d'un amplificateur d'alimentation, puis branchez la sortie de l'amplificateur aux fils de l'électrode. Couvrir tous les fils électriques et des surfaces de l'installation avec du ruban électrique pour protéger les utilisateurs de l'exposition potentielle à un choc. Un diagramme schématique de la configuration du matériel est montré dans la figure 1A. Régler le générateur de fonctions pour produire une sortie d'onde sinusoïdale de 1,0-1,5 MHz. L'amplitude de la sortie doit être ajustée pour l'amplificateur de puissance RF pour produire une puissance de 80-100V à la carte. L'amplificateur de puissance RF dans ce travail nécessite une tension d'entrée autour de 220 à 330 mV. Pour séparer les cellules et les perles, le taux d'écoulement laminaire doit être conforme à la force DEP pour passer des cellules et des perles dans le canal principal (largeur w = 100 um, la hauteur h = 27 um) dans les canaux de cible (largeur w = 100 um , hauteur h = 27 m). Attention: consulter le fabricant de PCB pour déterminer les mtensions de fonctionnement MAXIMALE pour éviter des problèmes tels que la surchauffe des PCB ou de fusion. Vérifiez les spécifications du fabricant de l'équipement pour le générateur de fonctions et de fabricants d'amplificateurs de puissance pour déterminer les paramètres d'exploitation sûre. Initier DEP pour trier les cellules et les perles. Cellules expérience positive-DEP alors des billes de polystyrène expérience d'un négatif-DEP dans un domaine non-électrique uniforme dans les fréquences spécifiées. Cela permet DEP-force-activé bioactuation et de séparation des cellules et d'autres particules dans des dispositifs microfluidiques en utilisant les PCB abordable et réutilisables comme électrodes. 6. Les résultats représentatifs: Lorsque DEP est efficace à des cellules d'actionnement ou de particules, un alignement robustes au sein non uniforme des champs électriques est observée pour les bains statiques ou vitesses de fluide lent. Dans des conditions de vitesses de fluide plus élevée, le comportement des cellules ou des particules dépend de l'orientation relative de l'écoulement axial du champ électrique et la vitesse d'écoulement. En outre, les comportements de cellules et de particules sont également tributaires de l'intensité du champ électrique et le degré de non-uniformité dans le domaine électrique. Les comportements typiques des cellules ou des particules comprennent des chaînes de perles, le cyclisme, décrochage, ou de tourner. Affections qui compromettent ou abolir DEP comprennent la présence de sels ou d'autres molécules dans le liquide ionique, faible intensité de champ électrique, les vitesses d'écoulement excessif, des lamelles qui sont trop épais, ou des solutions conducteur entre la lamelle et les électrodes PCB (par exemple une lamelle craqué peut induire le mélange d'eau et d'huile minérale). Ici, lorsque vous utilisez No.0 lamelles d'épaisseur (80 à 130 um) et une distance entre les électrodes d'(231 um), le gradient du carré de l'intensité du champ électrique appliqué à la-29 cellules HT et des perles est estimé à entre 2 -8 à 6 -8 V 2 / um 3 1. La force DEP peut être estimée en mesurant la vitesse de la particule, manipulés par des DEP dans un fluide statique (Figure 2A-B). En raison de la faible inertie de la particule et de l'environnement très visqueux du canal microfluidique, la force de traînée hydrodynamique sera égal à, mais en sens inverse avec la force DEP. La vitesse moyenne de billes dans la faible conductivité des médias est de 34,5 um / s avec une tension de 93 Vcc DEP et de 1,5 MHz. La force de traînée hydrodynamique peut être calculée avec l'équation suivante 1. F = glisser 6πηRv La viscosité moyenne η des médias faible conductivité à 20 ° C est de 1,27 mPa • s et le rayon R est de 7,5 um perles. La force de traînée hydrodynamique pour la microbille en polystyrène est estimé à 6,19 pN. Afin de démontrer la capacité d'actionner des perles dans les canaux microfluidiques (figure 2C-F), nous avons lancé le débit de la faible conductivité des médias-en employant des flux médiation tension de surface. La vitesse moyenne de billes dans le canal d'entrée unique a été 1540 um / sec, tandis que la vitesse moyenne dans les canaux individuels a été réduit à 565 um / sec (figure 2C). En initiant DEP, les billes ont été retenus dans le canal central, plutôt que d'être rejetées dans le canal latéral. Ainsi, dans ces conditions, les forces de DEP ont été suffisantes pour surmonter la force de traînée du fluide dans les deux canaux latéraux. Le même principe a également été utilisé pour détourner les perles de la Cannel au centre d'un canal latéral simple en changeant simplement l'orientation des canaux et les flux de talon à celle des électrodes PED (Figure 2E-F). En inclinant le électrode métallique sur le côté du canal d'entrée unique, quand DEP a été lancé, les billes ont été guidés vers le côté de la chaîne comme les perles approché le point de bifurcation. Là, les forces de DEP ont été suffisantes pour tirer les billes dans l'un des canaux secondaires, où le flux laminaire continué à les propulser vers le canal (figure 2F). Parce que les cellules et les billes de polystyrène ont de nettes différences dans leur capacité à être polarisée et actionné au non-uniforme des champs électriques, nous utilisons DEP afin de démontrer la capacité d'effectuer la séparation sur-puce de cellules et de perles, simultanément. Nous avons utilisé la structure même canal microfluidique et les électrodes PCB tel que configuré dans la figure 2E-F, mais introduit une suspension de cellules HT-29 et des perles de faible conductivité des médias dans le canal d'entrée unique (figure 3). Lorsque le DEP est introduit, et dans ces conditions, le HT-29 cellules ont été conservées dans les deux canaux de sortie gauche, alors les billes ont été retenus dans le canal de sortie individuelle sur la droite. Ici, les cellules ont un comportement caractéristique «perle de chaînage» comme elles sont collectées dans le canal de sortie gauche. Parfois un bourrelet et la cellule sont attachés ensemble dans lequel ils sont rassemblés, souvent dans les canaux de sortie de la cellule. De cette expérienceal de données, nous déterminons le taux de tri à 713 particules (cellules et des perles) par minute, soit l'équivalent de 14 260 cellules et des perles en 20 minutes. Le nombre de cellules et de perles trouvés utiles et pertinentes pour la biologie moléculaire, l'imagerie, biochimiques et de laboratoire-sur-une-puce applications. Figure 1. PCB-DEP, des cellules et des particules dans les canaux microfluidiques. (A) La configuration de l'équipement pour le DEP basé actionnement commence par un générateur de fonctions pour définir la fréquence et l'amplitude du signal électrique, puis un amplificateur de puissance pour augmenter la puissance du signal du champ électrique généré sur le PCB. (B) L'Assemblée dispositif microfluidique pour l'actionnement de l'échantillon se compose de canaux microfluidiques en PDMS irréversiblement lié à un pas. 0 épaisseur (80 à 130 um) lamelle grâce à un plasma d'oxygène, non conducteurs de se baigner les cellules et / ou des perles. (C) Les électrodes PCB utilisé ici se composent de deux régions où les électrodes sont interdigitées pour générer une forte non-uniforme du champ électrique. (D) Le dispositif complété: un PCB avec un dispositif microfluidique trifurqué sur une lamelle unique encart montre l'ensemble du dispositif avec des fils de l'électrode. (CD) Pour l'échelle, les mesures de PCB sont de 8,4 cm (l), 2,1 cm (W), avec 5 mm de large électrodes. Figure 2. Images représentant des cellules et des perles dans les canaux avant et pendant DEP actionnement. (A) 15 perles um polystyrène fluorescentes dans une solution à faible conductivité des médias dans un canal microfluidique en PDMS, sans flux laminaire (temps écoulé, de 1,23 sec.) (B) Dès l'initiation du DEP, les billes migrer vers les modèles d'électrodes PCB (bandes noires) plutôt que entre les électrodes (temps écoulé, 8,18 sec.) (C) Perles dans les mêmes canaux sous flux laminaire sont répartis entre les trois canaux séparés (le temps écoulé, 5,3 sec), lorsque le DEP est lancé (D), les billes sont actionnés seulement la circulation dans le canal central (temps écoulé, 4.3 sec). (E) En changeant l'orientation des chaînes aux électrodes PCB, les perles peuvent être différemment dirigée vers les canaux latéraux (F) en utilisant DEP plutôt que le canal central, comme indiqué dans (D). (EF) Le temps écoulé est 8.23 ​​sec et 5.16 sec, respectivement. Toutes les barres d'échelle = 100 pm. Figure 3. Images représentant des cellules et des perles dans les canaux avant et pendant DEP actionnement. (AB) Avant d'entreprendre DEP, une solution mixte d'adénocarcinome du côlon humain (HT-29) et le flux des cellules perles d'un canal à trois canaux de sortie séparés. La flèche ouverte identifie le sens d'écoulement laminaire et les canaux sont décrits avec des lignes pointillées pour l'orientation et des éclaircissements. (CD) par DEP induisant, de perles et les cellules sont sélectivement actionné en canaux séparés identifiés. Cellules HT-29 de sortie du canal central et gauche, tandis que la sortie des perles sur le canal droit. Chaînage perle des perles et des caractéristiques des cellules est observée au cours du DEP actionnement. (A, C) d'imagerie de contraste interférentiel différentiel des cellules et des perles dans des microcanaux rend les perles facilement visibles. Glow Images échelle d'intensité (B, D) des mêmes images DIC (A, C) d'améliorer la visualisation des cellules dans les canaux. Les électrodes en métal réfléchissant ((A, C) à bande légère et (B, D) jaune et vert) fournissent un point de repère important pour l'alignement des microcanaux aux électrodes pour les PED efficaces à base d'actionnement. Barres d'échelle = 100 pm.