الخرز وفصل الخلايا في أجهزة ميكروفلويديك متعدد القنوات باستخدام Dielectrophoresis وتدفق رقائقي
Summary
Dielectrophoresis (DEP) هو وسيلة فعالة لمعالجة الخلايا. ويمكن لوحات الدوائر المطبوعة (PCB) توفير أقطاب رخيصة ، قابلة لإعادة الاستخدام وفعالة للاتصال خالية من التلاعب خلية داخل أجهزة ميكروفلويديك. من خلال الجمع بين PDMS المستندة إلى قنوات ميكروفلويديك مع coverslips على الكلور ، ونحن تثبت التلاعب حبة والخلية والانفصال داخل الأجهزة ميكروفلويديك الأقنية.
Abstract
تقدمت الأجهزة ميكروفلويديك دراسات الخلايا عن طريق توفير بيئة ديناميكية fluidic على مقياس من الخلية للدراسة ، والتلاعب ، والفرز والعد الخلايا. ومع ذلك ، والتلاعب في الخلايا داخل نطاق fluidic لا يزال يشكل تحديا ويتطلب بروتوكولات معقدة لتصنيع الصمامات وتشكيل الأقطاب ، أو مطالب المعدات المتخصصة مثل ملاقط بصرية. هنا ، علينا أن نظهر التي يمكن استخدامها التقليدية لوحات الدوائر المطبوعة (PCB) للتلاعب عدم الاتصال من خلال استخدام خلايا dielectrophoresis (DEP) للتلاعب حبة وخلية في مجالات تدفق الصفحي لbioactuation ، وحبة لخلية والانفصال في ميكروفلويديك الأقنية الأجهزة. أولا ، نقدم بروتوكول لتجميع الأقطاب والأجهزة DEP ميكروفلويديك ، وإعداد الخلايا لDEP. ثم ، لنا أن نشخص العملية DEP مع الخرز البوليسترين. أخيرا ، وتبين لنا نتائج ممثل فصل حبة وخلية في جهاز ميكروفلويديك الأقنية. باختصار ، DEP هي طريقة فعالة لمعالجة الجسيمات (الخرز أو الخلايا) داخل أجهزة ميكروفلويديك.
Protocol
Discussion
خلية التلاعب في أجهزة ميكروفلويديك أمر مرغوب فيه لفرز أو التنسيب الانتقائي للخلايا واحد أو لدراسات السكان. 2 يستخدم تدفق رقائقي بالتزامن مع صمامات ومضخات لمعالجة الخلايا داخل أجهزة ميكروفلويديك. ومع ذلك ، فإن هذه الأساليب وحدها هي صعبة وتتطلب عمليات تصنيع مفصل والمهارات 3 الطرد المركزي يمكن تبسيط طلبات التنسيب الخلية ولكن التصوير في وقت واحد يشكل تحديا ؛ وعلاوة على ذلك ، فإن هيكل لقناة الطرد المركزي يجب النظر بعناية عند تصميم المعالجات المطلوبة والنظر في الآثار القوات الجاذبية ، ويمكن استخدام ملاقط ليزر 4 موضع الخلية ولكن هذه الطريقة مكلفة وغير قابلة للفرز الخلايا عالية الإنتاجية. 5 ومع ذلك ، فقد ثبت DEP ونظام فعال لل"ملاقط الكهربائية" لوضع الخلية فعالة ، وتوصيف والتلاعب. 6،7
على وجه التحديد ، تم استخدام DEP لالتقاط نوع الخلايا بشكل انتقائي وعلى رقاقة لمعالجة الخلايا الميتة والحية ، 7-10 ، وجمع للخلايا الاستشعار عن الرنين لقياس كتلة الخلية. 11 لقد أثبتنا سابقا أن زيادة DEP القوة على البكتيريا او الخرز فوق fluidic قوة السحب ، ويمكن إنجاز التركيز على رقاقة ومحاصرة من الخرز البوليسترين والمستوحدة الليستيريا V7 (12). السكانية المختلطة E. القولونية ولام ويمكن أيضا أن توجه المستوحدة البكتيريا وأفرج عنه من خلال نبضات DEP. وعلاوة على ذلك ، يمكن التقاط الجزيئات الكبيرة تفاضلي والتي ركزت على الأقطاب على أساس حجم الجسيمات الكبيرة ، في حين يتم القبض على جسيمات أصغر ولكن لم تتم إزالة مع تدفق fluidic 13 عندما قوات DEP لا تغلب على قوى fluidic سحب على الجزئيات ، و لم يتم التقاط حبة أو خلية ، ولكنه انتقل بدلا داخل تيار fluidic. كما هو مبين في الشكل 2C ، يمكن أن تركز الخرز في المنطقة الوسطى من تيار السائل ما يكفي للاحتفاظ الخرز في القناة المركزية. هذا قد يكون راجعا إلى التأثير المشترك من الجسيمات إلى الجسيمات التأثيرات ضمن الحقل الكهربائي ، وسرعات أكبر من السوائل DEP سحب القوات ، ومزيج من هذه ، أو بعض التأثير الأخرى غير معروف.
أحدث التطورات في DEP تماس تسمح لتعظيم القبض على خلية والتلاعب مع حقل الحد الأدنى المطلوب ، وبالتالي حماية أنواع الخلايا ، إلى أقصى حد ، وخلال التلاعب DEP. 1،9 تلامس الوعد DEP يقدم للمجتمع على microfluidics للفرز وجمع ووضع الخلايا داخل أجهزة ميكروفلويديك. ونحن نتوقع أنه مع زيادة الطلب على ، وتنفيذ ، DEP للتلاعب داخل الأجهزة ميكروفلويديك والاكتشافات والابتكارات مزيد ستوسع التفاهم وتأثير قوى DEP.
ويمكن تصنيع الكلور من خلال ارتفاع حجم العمليات بأسعار في متناول الجميع مع الوقت تحول سريع تلفيق ، وجعلها منابر جيدة للتسويق. بالإضافة إلى ذلك ، الكلور هي سهلة الاستخدام ومتاحة للعلماء في مجموعة من التخصصات للتلاعب على رقاقة الخلية والفرز.
عند تصميم تخطيط الأقطاب الكلور ، ينبغي النظر في مسار الجسيمات / الخلية المطلوبة. العوامل الرئيسية التي ينبغي النظر فيها حجم الجسيمات ونوع (حبة و / أو خلية) ، نوع من الخلايا ، وحجم متناهية ، وسرعة تدفق ، والمباعدة بين القطب (الذي يحدد شدة المجال الكهربائي) ، وسمك ساترة ، والموصلية السوائل. هذه العوامل تؤثر على القوة المطلوبة والمتاحة لمعالجة الجسيمات أو الخلية ، وبالتالي كفاءة الانفصال. بروتوكول نعرضها هنا يدل على الإعداد الفعلي لبدء DEP لmicrosphere وفصل الخلايا. للتطبيقات المحتملة ، يجب على المستخدمين تطابق بنية تصميم قناة ميكروفلويديك مع مسارات تدفق المطلوب للخلايا والخرز ، فضلا عن أنماط الكهربائي لتحسين الكفاءة لكل تطبيق. ويمكن استخدام تباعد الكهربائي وسمك ساترة وفقا للمبادئ التوجيهية ذكرت سابقا عند تصميم تخطيط قناة ميكروفلويديك 1
يجب أن الموصلية والسماحية للخلية / الجسيمات وسائل الإعلام المحيطة تكون مختلفة بما يكفي لتيسير DEP إيجابية أو سلبية ، مع الحفاظ على خلايا سليمة. يمكن تحديد قطبية DEP عن جسيمات كروية من جزء حقيقي من قيمة معقدة من العوامل كلوسيوس – Mosotti التالي في تكرار الجهد ω DEP.
المعادلة 1
في هذا ε المعادلة ، هي السماحية ، σ هو الموصلية ، وε * السماحية هي معقدة. والحروف السفلية وع مللدلالة على الجسيمات وسائل الإعلام ، على التوالي. عندما خلية لديها أعلى السماحية من وسائل الإعلام ، أو الجزء الحقيقي للعامل كلوسيوس – Mosotti تصبح إيجابية ، فإن الجسيمات ويصبح أكثر استقطابا من وسائل الإعلام المحيطة بها. بسبب وجود حقل كهربائي غير موحدة ، والاستقطاب للجسيمات يصبح غير موحدة ، وهذا يخلق DEP الموجب (+ DEP) القوة التي توجه الخلية تجاه المنطقة مع ارتفاع شدة المجال الكهربائي. إذا خلية لديها أقل من السماحية وسائل الإعلام المحيطة بها ، أو الجزء الحقيقي للعامل كلوسيوس – Mosotti يصبح سلبيا ، فإنه يخضع DEP سلبي (- DEP) ، ويتم فرض الخلية تجاه المنطقة حقل الحد الأدنى. إذا كانت الخلية وسائل الاعلام تقريبا نفس السماحية معقدة ، يمكن إنشاء أي قوة لمعالجة الخلية. لهذا السبب ، والمياه النقية وسائل الاعلام هو المفضل للتلاعب الجسيمات DEP. ومع ذلك ، لتجنب الضغط الاسموزي على الخلية من الماء النقي ، وضعت وسائل الاعلام الموصلية المنخفضة للحفاظ على التوصيل دون تغيير ، ولكن لزيادة الضغوط لخفض الأسمولية التناضحي إلى الخلايا. وسائل الاعلام التقليدية ثقافة الخلية أو مخازن الفسيولوجية ، مثل DMEM أو برنامج تلفزيوني ، والموصلية العالية ، والتي لا تصلح للتلاعب DEP.
علينا أيضا أن أظهرت في وقت سابق ان يمكن التقاط الخلايا على أجهزة الاستشعار مع DEP باستخدام وسائل الإعلام الموصلية المنخفضة. بعد فترة وجيزة لمرفق الخلية ، يمكن استبدال وسائل التوصيل المنخفضة للثقافة وسائل الإعلام الخلية المطلوبة لدعم نمو الخلايا لعدة أيام. 11
من تجربتنا ، والخرز نيون مشرقة للغاية فيما يتعلق مضان الخلية الحية ، وبالتالي فإنه يمكن أن يشكل تحديا لتتناسب مع شدة حبه لكثافة خلية حية والاستشعاع. لتحسين التصور من الخلايا على حد سواء ، والخرز ، واستخدمنا المجهري مدينة دبي للإنترنت على المجهر تستقيم التصوير على حد سواء. لعرض الخلايا والخرز ، وقدمنا البيانات في صورة توهج النطاق الكثافة ، التي تحتفظ البيانات في ألوان الطيف واسعة لعرض أسهل. وهكذا ، عند تصميم هذه الدراسة من الفائدة ، لا بد من النظر في معلمات التصوير والموارد.
باختصار ، علينا أن نظهر القدرة على تحفيز الخلايا بشكل انتقائي الخرز وإلى قنوات منفصلة باستخدام DEP. مع الأداة المساعدة المتزايدة للقنوات ميكروفلويديك للبيولوجيا الخلية والكيمياء الحيوية والهندسة الحيوية التطبيقات ، DEP هو خيار مرغوب فيه لجمع خلية والتنسيب والفرز. تلفيق أقطاب PCB هي رخيصة ومريحة ، والأقطاب هي سهلة الاستخدام ، وأوقات تلفيق السريع مثالية لتنفيذ DEP.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نعرب عن تقديرنا لوو تشانغ جين لتوفير قنوات للtrifurcating يشتغل DEP وميتشل Collens لمساعدته في إعداد المعدات. وقد دعمت الولايات المتحدة العمل من قبل جبهة الخلاص الوطني من خلال المنح OISE – 0951647 وتايوان من خلال مجلس الأمن القومي 99-2911-1-002-007 المنحة.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Sylgard 184 kit (PDMS) | Elsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | Dow Corning Sylgard | |
| 16 awg hook-up wire | Belden | 8521 | (Type MW) Mil-W-76C-PVC | |
| Gold seal Cover Glass | Ted Pella | 260320 | No. 0 thick, 24 x 60 mm | |
| Miltex Biopsy Punch | VWR Scientific | 95039-104 | Miltex, assorted sizes | |
| Custom PCB electrodes | Bay Area Circuits | Custom parts | ||
| Mineral oil | Fisher Scientific | O121-1 | ||
| Deionized water | House DI water supply | None | Use filtered DI water | |
| D-Glucose Anhydrous Granular AR | Mallinckrodt Chemicals | 4912-06 | ||
| Sucrose, Crystal | Mallinckrodt Chemicals | 8360-06 | ||
| Fluorescent polymer microspheres | Bangs Laboratories | FS07F/9277 | 15μm Dragon green microspheres | |
| HT-29 cell line | ATCC | HTB-38D | Human colon adenocarcinoma | |
| Typsin 0.05% EDTA | Invitrogen | 25300054 | ||
| Eclipse E600FN upright microscope | Nikon | Eclipse E600FN | ||
| Phantom V310 High-speed imaging camera | Phantom | V310 | ||
| BX51 upright research microscope | Olympus | BX51 | ||
| SpotFlex high resolution color camera | Diagnostic Instruments | FX1520 | ||
| Function generator | Agilent | 3325A | ||
| RF Power amplifier | EIN | 2100L |
References
- Park, K., Suk, H. J., Akin, D. Dielectrophoresis-based cell manipulation using electrodes on a reusable printed circuit board. Lab Chip. 9, 2224-2224 (2009).
- Nilsson, J., Evander, M., Hammarstrom, B. et al., Review of cell and particle trapping in microfluidic systems. Anal. Chim. Acta. 649, 141-141 (2009).
- Fu, A. Y., Chou, H. P., Spence, C. An integrated microfabricated cell sorter. Anal. Chem. 74, 2451-2451 (2002).
- Rhee, S. W., Taylor, A. M., Cribbs, D. H. External force-assisted cell positioning inside microfluidic devices. Biomed. Microdevices. 9, 15-15 (2007).
- Zhang, H., Liu, K. K. Optical tweezers for single cells. J. R. Soc. Interface. 5, 671-671 (2008).
- Hunt, T. P., Westervelt, R. M. Dielectrophoresis tweezers for single cell manipulation. Biomed. Microdevices. 8, 227-227 (2006).
- Vahey, M. D., Voldman, J. An equilibrium method for continuous-flow cell sorting using dielectrophoresis. Anal. Chem. 80, 3135-3135 (2008).
- Burgarella, S., Bianchessi, M., Merlo, S. A Modular Platform for Cell Characterization, Handling and Sorting by Dielectrophoresis. Cytometry A. 77A, 189-18 (2010).
- Shafiee, H., Sano, M. B., Henslee, E. A. Selective isolation of live/dead cells using contactless dielectrophoresis (cDEP). Lab Chip. 10, 438-438 (2010).
- Vahey, M. D., Voldman, J. High-Throughput Cell and Particle Characterization Using Isodielectric Separation. Anal. Chem. 81, 2446-2446 (2009).
- Park, K., Jang, J., Irimia, D. Living cantilever arrays’ for characterization of mass of single live cells in fluids. Lab Chip. 8, 1034-1034 (2008).
- Gomez-Sjoberg, R., Morisette, D. T., Bashir, R. Impedance microbiology-on-a-chip: Microfluidic bioprocessor for rapid detection of bacterial metabolism. J. Microelectromech. Syst. 14, 829-829 (2005).
- Li, H. B., Zheng, Y. N., Akin, D. Characterization and modeling of a microfluidic dielectrophoresis filter for biological species. J. Microelectromech. Syst. 14, 103-103 (2005).
