Расширение, очистки и функциональной оценки периферической крови человека клетки NK

1. Выделение МНПК от Баффи Coat Мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) получаются плавучей центрифугирования плотности на Ficoll-Paque от здоровых доноров лейкомассы образцы полученных лейкафереза. Ficoll-Paque центрифугирования делается как протокол на одного производителя с незначительными изменениями. Добавить PBS к нормальной донорской крови-банк лейкомассы до конечного объема 140 мл (типичное пальто Баффи объем 40-70 мл). Слой 35 мл образца пальто Баффи на 15 мл Ficoll-Paque (4 трубы). Центрифуга при 400g в течение 20 минут без тормозов. Восстановление МНПК от Ficoll-Paque: плазма интерфейс, не выбрасывайте эритроцитов на дне Ficoll-Paque. Вымойте МНПК три раза PBS, центрифугирования каждый раз при 400g в течение 10 минут. МНПК могут быть использованы непосредственно для НК расширения ячейки на этом этапе или NK клетки могут быть выделены путем RosetteSep (раздел 4) Оставшиеся МНПК могут быть заморожены в ФБС, содержащего 10% ДМСО в жидком азоте. Аспирируйте Ficoll и собирать эритроциты, начиная с шага 5 на две трубки центрифуги 50 мл, мыть три раза PBS (добавляют к 50 мл отметки), каждый раз аспирата супернатант скимминга верхней части слоя РБК удалить гранулоцитов. Эритроциты могут быть использованы непосредственно для RosetteSep  очистки НК-клеток (см. раздел 4) или храниться в равном объеме решение Alsever это при 4 ° C для дальнейшего использования (эритроциты можно хранить в течение не более 4 недель). 2. Н. К. сотовый расширения Расширение NK клетки может быть начато использование МНПК или очищенной NK клеток. Количество МНПК использоваться для расширения может варьироваться в зависимости от количества НК клетки желаемого в конце трехнедельного расширения, обратитесь к представителю результаты разделе. (См. примечание 1) СТИМУЛЯЦИЯ 1 День 0 Для каждого 5×10 6 МНПК быть расширен, считать и облучать 10×10 6 К562 CL9 mIL21 с помощью гамма-облучатель при 100 Гр. Сообщение облучения, мыть клетки с PBS и ресуспендируют в НК ячейки расширения носителя (NKEM). Семенной 5×10 6 МНПК с 10х10 6 облученных К562 CL9 mIL21 (1:2) в 40 мл NKEM в T75 колбу и поместить его в вертикальном положении в инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% СО 2. Дни 3 и 5 Восстановление клетки центрифугированием при 400g в течение 5 мин и заменить половину средств массовой информации со свежими NKEM (добавление свежей Ил-2 для всего объема средств массовой информации) и продолжить культуры. СТИМУЛЯЦИЯ 2 День 7 Подсчитайте количество клеток в культуре в конце недели. Отложите 5х10 5 клеток для фенотипирование методом проточной цитометрии (см. примечание 2) Для каждого 5×10 6 ячеек, которые будут restimulated, считать и облучать 5×10 6 К562 CL9 mIL21 с помощью гамма-облучатель при 100 Гр. Добавить равное количество облученных К562 CL9 mIL21 (1:1) и ресуспендируют в NKEM на 2.5×10 5 всего клеток / мл (см. Примечание 3). Семенной клеток в колбах T75 (максимум 50 мл на флакон). Дни 10 и 12 Подсчитайте количество клеток. Изменение всей СМИ со свежими NKEM на основе числа клеток (см. Примечание 3). День 14 В конце две недели расширения подсчета количества клеток в культуре. Отложите 5х10 5 клеток для фенотипирование методом проточной цитометрии (см. примечание 2) Если экспансия началась с МНПК NK клетки могут быть очищены на данном этапе расширение с помощью протокола RosetteSep очистки (см. раздел IV). Если расширение началось из очищенных натуральных киллеров переходите к стимуляции 3. После очистки отложить 5х10 5 клеток для фенотипирование методом проточной цитометрии для проверки чистоты NK клеток (как в шаге 8). Приступить к стимуляции 3, используя все очищенные клетки NK (См. примечание 4). СТИМУЛЯЦИЯ 3 Ресуспендируют NK клеток с облученным К562 CL9 mIL21 (1:1) в NKEM на основе числа клеток (см. Примечание 3). Дни 17 и 19 Подсчитайте количество клеток. Изменение СМИ со свежими NKEM на основе числа клеток (см. Примечание 3). День 21 По истечении трех недель расширения подсчета количества клеток в культуре. Восстановление 1×10 6 клеток для анализа потока цитометрии для полного ячейки NK панели антител фенотипирование (см. Таблицу 1). Замораживание клеток в ФБС, содержащий 10% ДМСО при максимальной плотностью 5х10 7 клеток на флакон для будущего использования. 3. Н. К. сотовый Цитотоксичность Пробирной Оттепель флакон НК-клеток и семян NKEM, за день до ЧПrforming цитотоксичность анализа, чтобы восстановление. Для каждого НК анализа цитотоксичности клеток с использованием одной линии клеток-мишеней, 6×10 5 NK клеток и 3х10 5 клеток-мишеней не требуется (см. примечание 5). Подготовка CAM-Медиа путем разбавления кальцеин-AM (акции 1 мг / мл в ДМСО) в NKEM (См. примечание 6). Ресуспендируют 10 6 клетки-мишени в 1 мл CAM-медиа (см. Примечание 7). Инкубируйте в течение 1 часа при температуре 37 ° C, при периодическом встряхивании. Ресуспендируют NK клеток на 1×10 6 клеток / мл и добавить 200uL НК клеточной суспензии для каждого из 3 скважин U-дно 96-луночного планшета соответствующие до 10: 1 E: T соотношение показано на рисунке 1. (См. Примечание 8) Добавить 100 мкл полной СМИ, чтобы все оставшиеся лунки за исключением "Максимум". Добавить 100 мкл 2% Тритон Х-100 на "Максимум". Выполните серийные разведения NK клеток для последующей 5 E: T отношений путем передачи 100 мкл клеток каждый раз, хорошо перемешать. Отменить 100 мкл из последних скважин (E: T отношение 0.3125:1). Через 1 час загрузки кальцеин, мыть клетки-мишени в NKEM дважды, центрифугирования в течение 5 мин при 1200 оборотах в минуту. (См. Примечание 9) Пересчет клеток-мишеней и ресуспендируют в 1х10 5 клеток / мл. Добавить 100 мкл клеток-мишеней в каждую лунку (1×10 4 / а). Центрифуга в течение 1 мин на 100 г инициировать ячейки контакта. Инкубировать при 37 ° С и 5% CO 2 в течение 4 часов. Смешайте культуры осторожно с помощью пипетки с 100 мкл pipetter для того, чтобы равномерно приостановить выпущен кальцеин, замедления вращения пластины на 100 г в течение 5 минут для осаждения клеток и передачи 100 мкл надосадочной к новой пластинкой заботясь, чтобы избежать пузырей. Поп пузыри, которые могут форму с помощью тонкой иглы. Прочитано пластины с использованием флуоресцентных читателя пластины (возбуждение фильтра 485 нм, эмиссия фильтр 530 нм). Нижняя читать рекомендуется. Рассчитать процент Конкретные Лизис по формуле [(тестовый релиз-спонтанное выделение) / (максимальное релиз – спонтанное выделение)] х 100. 4. Н. К. сотовый Очистка RosetteSep Возьмите 100-кратного избытка эритроцитов, что и МНПК или расширенных клеток, в 50 мл трубки (100:1 РБК: МКПК). Если вы используете свежие эритроциты приступить непосредственно к следующему шагу, или если эритроциты хранились в растворе Alsever с, подсчитать количество эритроцитов и промыть соответствующий (100-кратного избытка) количество эритроцитов с PBS с добавлением 2% ЭТС три раза, центрифугирования при 1200 оборотов в минуту в течение 10 минут каждый раз. Комбинат эритроцитов с МНПК с шагом 1,7 или расширенных клетки шагом 2,10 в PBS + 2% ЭТС для конечного объема 1 мл на 5×10 7 из МНПК или расширенных клеток. Добавить 1 мкл из RosetteSep  человеческих клеток NK обогащению Коктейль на 1×10 6 из МНПК или расширенных клеток. Хорошо перемешать и инкубировать при комнатной температуре в течение 20 минут с нежным смешивания каждые 5 минут. Добавить равным объемом PBS + 2% смеси FBS мягко и слой поверх Ficoll-Paque. Повторите шаги Ficoll-Paque центрифугирования описано для изоляции РВМС (раздел I). Граф Н. К. клетки восстановились после очистки и отложите 5×105 клеток для phenotpying методом проточной цитометрии для НК ячейки чистоты (Шаг 8). 5. Примечания ПРИМЕЧАНИЕ 1. НК-клеток может быть расширен непосредственно из МНПК, или от RosetteSep  очищенной NK клеток. Мы отметили, аналогичные эффективность расширения, но некоторые доноры могут иметь очень низкие НК номера сотовых в результате чего трудности очистки от RosetteSep до расширения. ПРИМЕЧАНИЕ 2. Мы обычно используют CD56-FITC, CD16-PE и CD3-PE-Cy5 для фенотипирование в ходе расширения, перечисляя НК-клеток, как те, которые CD3-отрицательных и CD16-CD56 или-положительными. ПРИМЕЧАНИЕ 3. При каждом изменении СМИ или стимуляции, ресуспендирования клеток в 2,5 х 10 5 / мл держать РВМС / NK на номера сотовых или менее 2 миллионов на мл на пике стадии расширения. Это позволит предотвратить истощение питательных веществ и помочь в достижении максимального расширения и выживания. Примечание 4. НК скорость расширения доноров зависимых и в конце стимуляции 1 или 2 части клетки могут быть заморожены, а часть еще больше расширить в зависимости от экспериментальных нужно. У нас были хорошие успехи в использовании замороженных клеток для разложения на более позднее время. ПРИМЕЧАНИЕ 5. В целях обеспечения права на ошибку мы рекомендуем использовать не менее 7х10 5 NK клетки ресуспендировали в 700 ULS из NKEM и 4×10 5 кальцеин-АМ окрашенные клетки-мишени ресуспендировали в 4 мл NKEM для создания цитотоксичность анализа. При использовании многоканальной пипетки для посева клеток-мишеней больших объемов ячеек (до 6×10 5 в 6 мл) могут потребоваться в зависимости от размера средств массовой информации бассейна используется. Также рекомендуется НК номера сотовых специально для E: T отношения шоу в протокол, для использования более высоких E: T соотношение увеличенияНК номера сотовых на мл соответственно (например, для 40:1 E: T соотношение использования 4×10 6 клеток / мл) ПРИМЕЧАНИЕ 6. Рекомендуется выполнять предварительные кальцеин-АМ загрузки титрования для линии клеток-мишеней выбора, используя следующие разведения 1:500, 1:400. 1:300, 1:200 и 1:100 для достижения оптимальной разницу между максимальной и спонтанное освобождение. ПРИМЕЧАНИЕ 7. При использовании приверженцем клеточной линии, как цель, сначала подготовить суспензии отдельных клеток с использованием не-ферментативной клеточной диссоциации буфера. При выполнении ADCC, готовят дубликаты трубки клеток-мишеней в CAM-медиа. ПРИМЕЧАНИЕ 8 При выполнении ADCC, добавить же NK клетки 3 скважины соответствующей 10:01 E:. Т для ADCC. Повторите эти действия для дополнительных доноров. Повторите эти действия для дополнительных клеток-мишеней. Примечание 9. При выполнении ADCC эксперимента, после 45 минут загрузки кальцеин, добавьте 10ug из антител, специфичных для стимулирования ADCC против клеток-мишеней. После 15 минут, промойте клетки-мишени в полной среде в два раза, центрифугирования в течение 5 мин при 1200 оборотах в минуту. Ресуспендируют клеток 1х10 5 клеток / мл и приступить к следующему шагу в протокол. 6. ПРЕДСТАВИТЕЛЬ РЕЗУЛЬТАТЫ Рисунок 2. Когда расширение выполняется согласно схеме, описанной выше, с использованием 5×106 МНПК в качестве исходного материала, типичные НК клетка дает диапазон от 1×10 9 до 10 10 клетки (донора зависимыми изменчивость). На рисунке показана НК ячейки раза расширения (п = 19) по сравнению с НК клетки, присутствующие в оригинальный продукт (средний + / – квартиль). Рисунок 3. Расширены клетки NK выражения различных NK-клеточных рецепторов, которые сопоставимы с невспененные первичной NK клеток с несколькими исключениями (CD11b, CD160 и CD244). Рисунок 4. МНПК восстановление после Баффи пальто доноров зависимым и может варьироваться от 6 до 300×10 800×10 6. NK клетки могут включать в себя 2% – 18% МНПК. Для очистки RosetteSep расширенного клеток, восстановления чистых натуральных киллеров на 14 день составляет от 40-70%. Следуя рекомендуется протокол расширения и очистки, Н. К. чистоты ячейка 99% можно ожидать. Рисунок 5. Расширенное НК-клеток показали, цитотоксичности против ряда опухолевых клеточных линий, включая нейробластома, борьбы с отмыванием денег, остеосаркома и меланома (представительных AML убийство показано в процентах конкретных лизис).