Expansão, Purificação e Avaliação Funcional de Células NK do sangue periférico

1. Isolamento de PBMCs de Buffy Brasão Células mononucleares do sangue periférico (PBMC) são obtidos por centrifugação de empuxo sobre densidade Ficoll-Paque de doadores saudáveis ​​amostras obtidas por buffy coat leucaférese. A centrifugação Ficoll-Paque é feito como protocolo por fabricante, com pequenas modificações. Adicionar PBS a um doador de sangue normal-bancárias buffy coat para um volume final de 140 mL (volume casaco típico buffy é 40-70 mL). Camada de 35 mL de amostra buffy coat, em 15 mL de Ficoll-Paque (4 tubos). Centrifugar a 400 g por 20 minutos sem freio. Recuperar o PBMCs do Ficoll-Paque: interface plasma, não descartam a hemácias no fundo do Ficoll-Paque. Lavar PBMCs três vezes com PBS, centrifugação cada vez menos 400g por 10 minutos. PBMCs podem ser usados ​​diretamente para a expansão das células NK, nesta fase, ou células NK pode ser isolado por RosetteSep (Seção 4) PBMCs restantes podem ser congelados em FBS contendo DMSO 10% em nitrogênio líquido. Aspirar o Ficoll e recolher os glóbulos vermelhos a partir do passo 5 em duas tubo de centrífuga de 50 mL, lavar três vezes com PBS (adicionado a 50 mL marca), cada vez aspirar o sobrenadante desnatação do topo da camada de RBC para remover granulócitos. Os glóbulos vermelhos podem ser utilizados imediatamente para RosetteSep  purificação das células NK (consulte a Seção 4) ou armazenado em volume igual de solução Alsever é a 4 ° C para uso posterior (Os glóbulos vermelhos pode ser reservado para um máximo de 4 semanas). 2. NK expansão celular A expansão das células NK pode ser iniciado usando PBMCs ou purificada de células NK. A quantidade de PBMCs usado para a expansão pode ser variado com base na quantidade de células NK desejado no final de uma expansão de três semanas, consulte a secção representativa resultados para obter detalhes. (Ver Nota 1) ESTIMULAÇÃO 1 Dia 0 Para cada 5×10 6 PBMCs ser expandido, contagem e irradiar 10×10 6 K562 CL9 mIL21 usando um irradiador gama a 100 Gy. Pós-irradiação, lavar as células com PBS e ressuspender em células NK expansão media (Nkem). Semente de 5×10 6 PBMCs com 10×10 6 irradiados K562 CL9 mIL21 (1:2) em 40 mL de Nkem em um frasco T75 e colocá-lo na posição vertical em uma incubadora a 37 ° CO C e 5% 2. Dias 3 e 5 Recuperar as células por centrifugação a 400g por 5 min e substituir metade da mídia com Nkem fresco (adicionando IL2 fresco para o volume de mídia inteira) e continuar a cultura. ESTIMULAÇÃO 2 Dia 7 Contar o número de células em cultura no final de uma semana. Separe 5×10 5 células para fenotipagem por citometria de fluxo (ver nota 2) Para cada 5×10 6 células para ser restimulated, contagem e irradiar 5×10 6 K562 CL9 mIL21 usando um irradiador gama a 100 Gy. Adicionar um número igual de irradiados K562 CL9 mIL21 (1:1) e ressuspender em Nkem em 2.5×10 5 total de células / mL (Ver Nota 3). Células de sementes em frascos T75 (máximo 50 mL por frasco). Dias 10 e 12 Contar o número de células. Mudança de mídia inteira com Nkem fresco com base no número de células (Veja Nota 3). Dia 14 No final de duas semanas de expansão contar o número de células em cultura. Separe 5×10 5 células para fenotipagem por citometria de fluxo (ver nota 2) Se a expansão foi iniciada a partir de PBMCs as células NK pode ser purificado nesta fase de expansão utilizando o protocolo de purificação RosetteSep (consulte a Seção IV). Se a expansão foi iniciada a partir de células NK purificada proceder à estimulação 3. Após purificação de lado 5×10 5 células para fenotipagem por citometria de fluxo para verificar a pureza das células NK (como no Passo 8). Prosseguir com Estimulação 3 usando todas as células NK purificado (ver Nota 4). ESTIMULAÇÃO 3 Células NK ressuspender com irradiados K562 CL9 mIL21 (1:1) em Nkem com base em números de células (ver nota 3). Dias 17 e 19 Contar o número de células. Mudança de mídia com Nkem fresco com base no número de células (ver nota 3). Dia 21 No final de três semanas de expansão contar o número de células em cultura. Recuperar 1×10 6 células para análise de citometria de fluxo para o pleno NK painel de anticorpos de células fenotipagem (Ver Tabela 1). Congelar células em FBS contendo DMSO 10%, a uma densidade máxima de 5×10 7 células por frasco para uso futuro. 3. NK ensaio de citotoxicidade celular Descongelar um frasco de células NK e sementes em Nkem, um dia antes da performing ensaio de citotoxicidade para permitir a recuperação. Para cada ensaio de células NK citotoxicidade usando uma linha única célula-alvo, 6×10 5 células NK e 3×10 5 células-alvo são exigidos (ver nota 5). Prepare CAM-Media diluindo calceína-AM (estoque 1 mg / mL em DMSO) em Nkem (Ver Nota 6). Ressuspender 10 6 células-alvo em 1 mL de CAM-media (ver nota 7). Incubar por 1 hora a 37 ° C, com agitação ocasional. Células NK ressuspender em 1×10 6 células / mL e adicionar 200uL de suspensão de células NK a cada um dos três poços de um U-bottom 96 poços da placa a 10 correspondentes: 1 razão E: T mostrado na Figura 1. (Ver Nota 8) Adicione 100uL de mídia completo para todos os poços restantes, exceto para "Máximo". Adicione 100uL de 2% Triton X-100 a "máxima". Realizar diluições em série das células NK para a E 5 subseqüentes: relações T, transferindo 100uL de células de cada vez, misture bem. Descartar 100uL dos poços passado (razão E: T de 0.3125:1). Após 1 hora de carregamento calceína, lave as células-alvo em Nkem duas vezes, centrifugação por 5 min a 1200 rpm. (Ver Nota 9) Re-contar as células-alvo e ressuspender em 1×10 5 células / mL. Adicionar 100 mL de células-alvo para cada poço (1×10 4 / bem). Centrifugar por 1 min a 100g de iniciar o contato da célula. Incubar a 37 ° C e 5% CO 2 por 4 horas. Misture delicadamente a cultura por pipetagem com uma pipeta de 100 L, a fim de suspender a uniformemente calceína lançado, spin down placa de 100g por 5 minutos para sedimentar as células e transferir 100 mL do sobrenadante para um novo prato com cuidado para evitar bolhas. Pop as bolhas que se podem formar com agulha fina. Leia a placa usando um leitor de placas fluorescentes (excitação filtro de 485 nm, a emissão de filtro de 530 nm). Leitura de fundo é recomendado. Calcule Lise Percentual específicas de acordo com a fórmula [(versão de testes de liberação espontânea) / (liberação máxima – liberação espontânea)] x 100. 4. NK Purificação celular por RosetteSep Tome de 100 vezes o excesso de glóbulos vermelhos ao de PBMCs ou células expandidas, em um tubo de 50 mL (100:1 RBC: PBMC). Se usar os glóbulos vermelhos frescos prosseguir diretamente para a etapa seguinte ou se a hemácias foram armazenados em solução Alsever s, contar o número de hemácias e de lavagem adequados (100 vezes em excesso) quantidade de hemácias com PBS suplementado com 2% FBS três vezes, centrifugar a 1200 rpm por 10 minutos a cada vez. Combine com hemácias PBMCs a partir do passo 1.7 ou células expandidas a partir do passo 2,10 em PBS + 2% de SFB para um volume final de 1 mL por 5×10 7 de PBMCs ou células expandidas. Adicionar 1μL de RosetteSep  Human Enrichment Célula NK Cocktail por 1×10 6 de PBMCs ou células expandidas. Misture bem e deixe em temperatura ambiente por 20 minutos, com suave mistura a cada 5 minutos. Adicionar igual volume de PBS + 2% FBS mix suave e camada em cima de Ficoll-Paque. Repita os passos de Ficoll-Paque centrifugação descrita para o isolamento de PBMC (Seção I). Contagem das células NK recuperado após purificação e reserve 5×105 células para phenotpying por citometria de fluxo para NK pureza celular (Passo 8). 5. Notas NOTA 1. Células NK pode ser expandida diretamente de PBMCs, ou de RosetteSep  células purificadas NK. Temos observado a eficiência de expansão semelhante, mas alguns doadores podem ter muito baixo o número de células NK, resultando na purificação dificuldade RosetteSep antes da expansão. NOTA 2. Rotineiramente usamos CD56-FITC, CD16-PE, e CD3-PE-Cy5 para fenotipagem durante a expansão, enumerando as células NK como aqueles que são CD3-CD16 negativos e ou CD56-positivo. NOTA 3. A cada troca de mídia ou estimulação, as células ressuspender a 2,5 x 10 5 mL / para manter os números PBMC / NK de células iguais ou abaixo de 2 milhões por mL em estágios de pico de expansão. Isto irá prevenir a depleção de nutrientes e ajudar a alcançar a expansão máxima e sobrevivência. NOTA 4. A taxa de expansão NK é doador dependentes e no final de estímulos 1 ou 2 parte das células pode ser congelada e parte ampliada ainda mais, dependendo da necessidade experimental. Tivemos um bom sucesso na utilização das células congeladas por expansões em um momento posterior. NOTA 5. A fim de permitir espaço para erro recomendamos a utilização de um mínimo de 7×10 5 células NK ressuspenso em 700 uls de Nkem e 5 4×10 calceína-AM células-alvo manchada ressuspenso em 4 mL de Nkem para a configuração do ensaio de citotoxicidade. Se estiver usando uma pipeta multicanal para semeadura células-alvo volumes mais altos de células (até 6×10 5 em 6 mL) pode ser necessário com base no tamanho da mídia de bacia a ser utilizado. Também o número de células NK recomendado especificamente para a E: T mostram índices no protocolo, para a utilização de maior E: relações T aumentaro número de células NK por mL em conformidade (por exemplo, para um 40:1 E: T 4×10 uso proporção 6 células / mL) NOTA 6. Recomendamos realizar uma titulação calceína-AM carregamento preliminar para a linhagem de células-alvo de escolha, utilizando os seguintes diluições de 1:500, 1:400. 1:300, 1:200 e 1:100 para alcançar diferença ideal entre a liberação máxima e espontânea. NOTA 7. Ao usar uma linha de células aderentes como alvo, primeiro preparar a suspensão única célula usando não enzimático celular buffer de dissociação. Se estiver executando ADCC, prepare um tubo duplicata de células-alvo no CAM-media. NOTA 8 Se executar ADCC, adicione mesmas células NK a 3 poços correspondentes a 10:1 E:. T para o ADCC. Repita o procedimento para doadores adicionais. Repita o procedimento para as células-alvo adicional. NOTA 9. Se realizar um experimento ADCC, após 45 minutos de carregamento calceína, adicione 10ug de anticorpos específicos para induzir o ADCC contra as células-alvo. Após mais 15 minutos, lave as células-alvo em meio completo, duas vezes, centrifugação por 5 min a 1200 rpm. Ressuspender as células em 1×10 5 células / mL e prossiga com a próxima etapa do protocolo. 6. RESULTADOS REPRESENTANTE Figura 2. Quando a expansão é realizada conforme o esquema descrito acima, usando 5×106 PBMCs como matéria-prima, típica das células NK rendimento varia de 1×10 outubro 09-10 células (variabilidade doador dependente). A figura mostra a expansão de células NK vezes (n = 19) em comparação com as células NK presentes no produto original (média + / – quartil). Figura 3. As células NK expandidas expressar vários receptores de células NK que são comparáveis ​​aos unexpanded principal células NK com algumas exceções (CD11b, CD160 e CD244). Figura 4. PBMCs recuperação de Buffy coat é doador dependente e pode variar de 6 a 300×10 800×10 6. Células NK pode incluir 2% – 18% das PBMCs. Para a purificação RosetteSep de células expandidas, recuperação de pura células NK no dia 14 faixas de 40-70%. Seguindo o protocolo recomendado de expansão e purificação, a pureza das células NK de 99% pode ser esperado. Figura 5. Expanded células NK demonstraram citotoxicidade contra uma série de linhagens de células tumorais, incluindo neuroblastoma, AML, osteosarcoma e melanoma (representante matando AML mostrado como lise por cento específico).