Использование Всего горе На месте Гибридизация в ссылку молекулярной биологии и организменном

1. Плазмиды Преобразование целевых кДНК Часть I: Преобразование плазмиды (Необходимое время: 3 часа плюс ночной инкубации) Теплый SOC питательный бульон в 42 ° С водяной бане (500 мкл на реакцию) Оттепель компетентных клеток на льду Добавить 1 мкл плазмиды до 25 мкл компетентных клеток Место на льду в течение 20 минут Теплового шока клеток в 42 ° С водяной бане в течение 45 секунд Сразу же месте клетки на льду в течение 2 минут Добавить 500 мкл 42 ° C питательный бульон для каждого флакона клетки Встряска при 37 ° С в течение 2 часов при 255 оборотах в минуту (RPM) Пластина 75 мкл смеси преобразование Лурия Бертани (LB) пластин агара Инкубируйте пластин перевернутой при температуре 37 ° С в течение ночи Часть II: Е. кишечной культуры (Необходимое время: 15 минут плюс ночной инкубации) Для каждой реакции, аликвоту 3 мл LB бульоне и 3 мкл 50 мг / мл ампициллина в пробирку Очистите 1 бактерий колонии от агара тарелку и добавить в каждую пробирку Встряхните культуры труб при 37 ° С при 255 оборотов в минуту ночь Часть III: плазмиды Prep (Необходимое время: 1,5 часа) Изолировать плазмиды овернайт культур в 5 премьер FastPlasmid Kit Mini (Catalog # 2300000) Чтобы проверить наличие подготовленных плазмиды, запустить ДНК вымывают из комплекта на 1% Трис-ацетат-ЭДТА (TAE) гель окрашивали бромидом этидия 2. В Ситу DIG-меченых зондов Синтез РНК Часть I: Линеаризация плазмиды (Необходимое время: 2,5 часа) В трубке микроцентрифужную 1,5 мл, сочетать: Подготовлено плазмиды 20 мл * Ограничение ферментов 2 мл Буфер ** 10 мл 10X бычьего сывороточного альбумина (БСА) 10 мл Диэтиловый Pyrocarbonate (DEPC) вода 58 мл 100 мл Инкубировать при 37 ° С в течение 2 часов * Зависит от плазмиды ** Зависит от рестрикции Часть II: Транскрипция (Необходимое время: 3 часа) В трубке микроцентрифужную 1,5 мл, сочетать: Линейные плазмиды 4 мл 10X Буфер Транскрипция ** 4 мл Дигоксигенин Этикетка Mix 4 мл Полимеразная * 2 мл Ингибитор РНКазы 2 мл DEPC воды 24 мл 40 мл Инкубировать при 37 ° С в течение 1 часа Добавьте 2 мкл полимеразы * Инкубировать при 37 ° С в течение 1 часа Добавьте 2 мкл ДНКазы Инкубировать при 37 ° С в течение 20 минут * Зависит от плазмиды ** Зависит от полимеразы Часть III: Осадки (Необходимое время: 5 минут плюс 2 часа инкубации в течение ночи, 1 час к центрифуге и повторно приостанавливать) Добавьте 4 мкл 0,2 М ЭДТА Добавьте 5 мкл 4М хлорида лития Добавить 150 мкл ледяной 100% этаноле Инкубируйте при -80 ° С в течение 2 часов ночи Центрифуга при 14000 оборотов в минуту в течение 30 минут при температуре 4 ° С, переливать от надосадочной Сухие гранулы в течение 7 минут Повторное приостановить в 20 мкл воды DEPC Инкубировать при 37 ° С в течение 5 минут Часть IV: Фракционирование – выполняет только тогда, когда зонд размером свыше 0,6 кб (Необходимое время: варьируется в зависимости от размера зонда, как правило, не более 20 минут) В трубке микроцентрифужную 1,5 мл, сочетать: РНК-зонд 20 мл DEPC воды 12 мл Бикарбонат натрия 4 мл Карбонат натрия 4 мл 40 мл Инкубируйте в 60 ° С водяной бане. База времени инкубации по уравнению: Время (мин.) = (начиная кб – желаемый кб) / (0,11 х, начиная кб х желаемого кб) Средний желаемый размер = 0,6 кб Часть V: Заключительные осадков (Необходимое время: 5 минУтес плюс 2 часа инкубации в течение ночи, 1 час к центрифуге и повторно приостанавливать, 1 час для гель-электрофореза) Добавить 40 мкл DEPC воды Добавить 8 мкл ацетата натрия Добавить 1,04 мкл ледяной уксусной кислоты Добавить 240 мкл ледяной 100% этаноле Инкубируйте при -80 ° С в течение 2 часов ночи Центрифуга при 14000 оборотов в минуту в течение 30 минут при температуре 4 ° С, переливать от надосадочной Сухие гранулы в течение 7 минут Повторное приостановить в 20 мкл воды DEPC Vortex смешивать Чтобы проверить наличие riboprobe, запустите повторно приостановил решение на 1% гель окрашивали бромистым TAE этидия 3. Всего в гору гибридизация Часть I: Фиксация зародышей и протеиназы К Пищеварение (Необходимое время: Fix ночью плюс 4 часа следующего дня для хранения, 2,5 часа из хранилища Часть II) Сбор поставил данио эмбрионов и зафиксировать в 4% параформальдегида (PFA) в течение ночи при температуре 4 ° C Вымойте фиксированных эмбрионов в фосфатном буферном растворе, содержащем 0,1% Твин-20 (PBST) 3 раза в течение 10 минут каждый Для обеспечения воздействия эмбрионов экспериментальных реагентов, вручную dechorionate эмбрионов (при необходимости), используя с острым концом щипцов Дегидрировать эмбрионов путем промывки в градуированных серии по 25% и 50% метанола в PBST в течение одного часа каждый мыть, затем хранить в 100% метаноле при -20 ° C Когда все будет готово к использованию, увлажняет эмбрионов в PBST промывкой в ​​50% (2 раза) и 25% (1 раз) метанола в PBST в течение 10 минут каждый. Наконец мыть 2 раза в течение 10 минут каждый на 100% PBST. Точные сроки не важно для PBST / метанол моет Bleach эмбрионов в 10% раствор перекиси водорода в PBST, при необходимости, удалить темные пигменты. Эмбрионы должны инкубировать в раствором перекиси водорода в течение 10-20 минут, в зависимости от возраста эмбриона, и шапка микроцентрифужную трубка должна оставаться открытой, чтобы предотвратить наращивание давления воздуха Дайджест эмбрионов с 50 мг / мл протеиназы К разбавленным 1:5000 в PBST за 3-15 минут, в зависимости от возраста эмбриона Повторное исправление эмбрионов в 4% PFA в течение 30 минут, а затем промыть 3 раза в PBST в течение 5 минут каждый Часть II: Гибридизация Riboprobes (Необходимое время: 3 часа плюс ночь для гибридизации, 1,5 часа на следующий день в часть III) Prehybridize эмбрионов с prehybridization решение (PHS) в предварительно разогретой до 70 ° С на водяной бане 2-3 часа Удалить PHS, добавить 0,5 мл раствора гибридизации и 1,5 мкл ранее синтезированных меченых дигоксигенин riboprobes, инкубировать при температуре 70 ° С в течение ночи. Температура может колебаться в пределах нескольких градусов в зависимости от целевой riboprobe На следующий день, мыть эмбрионов при 70 ° С в градуированных растворов 75%, 50% и 25% PHS в 2х физиологическим раствором цитрата натрия (SSC) в течение 10 минут, затем промыть в 0,2 x SSC в течение 30 минут при 68 ° C Стирать в Малеиновый буфера кислота (МАБ) 2 раза в течение 10 минут каждый при комнатной температуре Часть III: Anti-дигоксигенин (α-DIG) Антитела Инкубационный (Необходимое время: 3 часа плюс ночь, чтобы блок, 2,5 часа на следующий день в часть IV) Трансфер эмбрионов на 12-луночного планшета Предварительно блок эмбрионов в 1-2 мл блокирующий раствор в течение 3 часов при комнатной температуре Одновременно, предварительно блок антител путем подготовки второго тома блокирующий раствор и разбавления анти-дигоксигенин антител 1:2000 в этом растворе Удалите предварительно блока и добавить 1-2 мл предварительно заблокировали α-DIG решение, инкубировать в течение ночи при 4 ° С На следующий день, мыть эмбрионов в МАБ. Разрешить эмбрионов для инкубации в МАБ в течение 5 минут, а затем выполнять буфера изменений и инкубировать в течение 10 минут два, один 30-минутный и один 60-минутный интервал. Точные сроки не нужно Вымойте эмбрионов 3 раза по 5 минут каждый в щелочной фосфатазы (AP) буфера Часть IV: Окрашивание и Окончательная обработка (Необходимое время: 1 час, чтобы на ночь для окрашивания, в зависимости от riboprobe использоваться, 4 часа до начала глицерина моет, 6-10 часов в глицерина мыть, можно хранить в глицерине) Добавьте 1-2 мл красящим раствором, чтобы эмбрионы, заверните в фольгу пластину и проверьте окрашивания регулярно (примерно каждые 20 минут), пока окрашивание достаточно Промыть эмбрионы с PBST 2 раза по 5 минут каждый, чтобы остановить реакцию окрашивания Дегидрировать эмбрионы, используя 10 минут моет в 25% (1 раз) и 50% (2 раза) метанола в PBST, то в 100% метанола, для удаления фона окрашивание Разрешить эмбрионов для инкубации в 100% метанола в течение 2 часов при комнатной температуре Увлажняет в PBST использованием 10 минут моет в 50% (2 раза) и 25% (1 раз) метанола в PBST, затем промыть в 100% PBST 2 раза Передача окрашенных электроннойmbryos на 80% глицерин в PBST, с помощью градуированных серии моет, и хранить при температуре 4 ° C. Рецепты: LB агаром-10 г LB агар + 250 мл дистиллированной воды, автоклав, когда прохладный на ощупь добавить 250 мкл ампициллин, залить 15-20 мл теплого раствора в каждую чашку Петри, агар позволяют укрепить LB-бульон 12,5 г LB бульоне + 200 мл дистиллированной воды, автоклав, дать остыть, прежде чем использовать 1% TAE геля 0,4 г агарозы, 40 мл 1X TAE, 2 мкл бромистого этидия; нагрузка 7 мкл плазмиды (плазмиды Преобразование целевых кДНК) или 3 мкл riboprobe и 4 мкл DEPC воды (на месте DIG-меченых зондов Синтез РНК) + 1 мкл красителя погрузки, 5 мкл лестницы ДНК Prehybridization решение-50% формамида, 5X SSC, 9.2 мм лимонной кислоты, 1% Твин-20 Гибридизация решение-prehybridization решение плюс 500 мкг / мл тРНК и 50 мкг / мл гепарина МАБ-100мм малеиновой кислоты, 150 мМ NaCl, 0,2 М NaOH, 0,1% Твин-20, рН до 7,5 Блокировка Решение-3 частей МАБ, 1 часть 10% Boehringer блокирующий реагент в МАБ, 1 часть тепла отключены ягненка сыворотке AP-60мм буфера Трис-HCl, рН 9,5, 60 мм NaCl, 30 мм MgCl 2, 0,1% Твин-20 Окрашивание Решение-5-бром-4-хлор-3-индолил фосфат (BCIP) и Nitro тетразолия (НБТ) в буфере А. П. 4. ПРЕДСТАВИТЕЛЬ РЕЗУЛЬТАТЫ При правильном выполнении реакции между НБТ, BCIP и щелочной фосфатазы образуют фиолетовый осадок, который должен появиться на эмбрион полосатого данио, как фиолетовые пятна. Riboprobes должны быть предварительно синтезированных из кДНК соответствующие гена. Таким образом, можно сделать вывод, любое пятно представляет визуализировать области полосатого данио, в котором интерес гена была переписана в этом конкретном этапе развития. Для целей данного курса riboprobes были синтезированы из aldh1a2 (ранее raldh2; Бегеманн и др., 2001;. Рис. 1); fgf8a (Reifers и др., 1998;. Рис. 2); deltaC (Оутс и др., 2005.); MyoD1 (Вейнберг и др., 1996.); shha (. Краусс и др., 1993), pax2a (Brand и др., 1996;. рис. 3) и myl7 (ранее cmlc2;. Yelon и др., 1999) кДНК. Окрашивание ожидалось в средней линии и в анатомических структур, включая сомитов, tailbud, myotome, мозг и сердце. Ace/fgf8a мутантов, как ожидается, имеют дефекты во многих из этих структур. Окрашивание было легко визуализированы с использованием стандартного рассекает микроскопом. Дополнительные источники содержат больше информации и устранение неполадок на WISH методы, подобные описанным здесь (Clark, 2003;. D'Коста и др., 2009; Schmoldt и др., 2009;. Schoenwolf, 2009). Рисунок 1. Данио эмбриона через 24 часа после оплодотворения, которая была гибридизации с riboprobes специфичные для aldh1a2. Специфическое окрашивание можно увидеть в глазах, задний мозг, почки грудного плавника зачатков, и сомитов. Передняя является верхней, задней находится на дно. Рисунок 2. Данио эмбриона на 13 сомитов этап развития, который был гибридизации с зондом, специфичные для fgf8a. Специфическая окраска наблюдается в конечном мозге, спинном промежуточный мозг, средний мозг, задний мозг границы, сомитов, а tailbud. Брюшной находится слева, спинной находится справа. Рисунок 3. 22 часа после оплодотворения эмбрион полосатого данио, которая была гибридизации с riboprobe специфичные для pax2a, надежный маркер полезны для визуализации нервной системы. Специфическое окрашивание можно увидеть в сосудистое трещина, средний мозг, задний мозг границы, слухового пузырька, и спинной нейронов мозга. Спинной зрения с впереди слева.