全マウントを使用するその場でハイブリダイゼーション

1。ターゲットcDNAのプラスミド形質転換パートI：プラスミドの形質転換 （所要時間：3時間プラス一晩インキュベーション） 42℃の水浴中で暖かいSOC栄養ブロス（反応あたり500μL） 氷上でコンピテントセルを融解 25μLのコンピテントセルにプラスミド1μLを追加 20分間氷上に置き、 45秒間42℃の水浴中で熱ショック細胞すぐに2分間氷上で細胞を配置細胞の各バイアルに42℃の栄養ブロスの500μLを追加 ° C毎分255回転で2時間（回転数）で37振るルリアベルターニ（LB）寒天プレート上にプレートを75μL変換ミックス 37℃で一晩反転プレートをインキュベートするパートII：E.大腸菌の培養 （所要時間：15分プラス一晩インキュベーション） それぞれの反応、アリコート3 mlのLB培養液および培養チューブに50 mg / mLのアンピシリンの3μLのための寒天プレートから1細菌のコロニーをかき取り、それぞれの培養チューブに加える 37℃で培養試験管を振る° Cを255 rpmで一晩パートIII：プラスミドプレップ （所要時間：1.5時間） 5内閣総理FastPlasmidミニキット（カタログ＃230万）を使用して一晩培養液からプラスミド分離する調製したプラスミドの存在を確認するには、エチジウムブロマイドで染色1パーセントトリス – 酢酸- EDTA（TAE）ゲルでキットから溶出したDNAを実行する （2） その場 DIG標識RNAプローブの合成で パートI：プラスミドの直線化 （所要時間：2.5時間） 1.5mlマイクロチューブに、組み合わせる。 プラスミド準備 20 mLの制限酵素* 2 mLのバッファー** 10mLの 10Xウシ血清アルブミン（BSA） 10mLのジエチルピロカーボネート（DEPC）水 58 mLの 100mLの 37℃で2時間インキュベート *プラスミドにより異なる **制限酵素により異なるパートII：トランスクリプション （所要時間：3時間） 1.5mlマイクロチューブに、組み合わせる。 線状プラスミド 4 mLの 10X転写バッファー** 4 mLのジゴキシゲニンでラベルのミックス 4 mLのポリメラーゼ* 2 mLの RNase阻害剤 2 mLの DEPC水 24 mlの 40mLの 1時間、37℃でインキュベートするポリメラーゼ* 2μLを追加 1時間、37℃でインキュベートする DNaseの2μLを追加 37℃を20分間 *プラスミドにより異なる **ポリメラーゼにより異なるパートIII：降水量 （所要時間：一晩のインキュベーション、1時間に5分プラス2時間は、遠心分離と再サスペンドする） 0.2M EDTAの4μLを追加 4M塩化リチウムの5μLを追加氷冷100％エタノールを150μLを追加一晩は-80℃で2時間インキュベート 4℃、デカント離れて上清を、30分間、14,000 rpmで遠心 7分のドライペレット 20μLのDEPC水に再懸 37℃を5分間パートIV：分画 – プローブのサイズが0.6 KBより大きい場合にのみ実行 （所要時間：通常は、プローブのサイズに基づいて20分以上を可変しない） 1.5mlマイクロチューブに、組み合わせる。 RNAプローブ 20 mLの DEPC水 12mlの重炭酸ナトリウム 4 mLの炭酸ナトリウム 4 mLの 40mLの 60℃の水浴でインキュベートする。方程式でのインキュベーション時間をベース： 時間（分）=（開始KB – キロバイトを希望する）/（KB X希望のKBを開始0.11 X） 平均的な希望のサイズ= 0.6キロバイトパートV：決勝降水量 （所要時間：5分一晩のインキュベーションにユートプラス2時間、遠心分離し、再一時停止する1時間、ゲル電気泳動のための1時間） 40μLDEPC水を加える 8μL酢酸ナトリウムを追加 1.04μL氷酢酸を追加 240μLの氷冷した100％エタノールを加えます一晩は-80℃で2時間インキュベート 4℃、デカント離れて上清を、30分間、14,000 rpmで遠心 7分のドライペレット 20μLのDEPC水に再懸ミックスする渦リボプローブの存在を確認するには、エチジウムブロマイドで1％TAEゲル染色した上、再懸濁液を実行する 3。 in situハイブリダイゼーション全山パートI：胚の固定およびプロテイナーゼK消化 （所要時間：修正晩プラス4時間のストレージのための次の日、2.5時間記憶からパートIIまで） ゼブラフィッシュ胚の段階収集し、4℃で一晩4％パラホルムアルデヒド（PFA）で修正° C リン酸固定胚を洗うことは10分ごとのTween – 20（PBST）で3回0.1％を含む緩衝生理食塩水先の細いピンセットを用いて実験的な試薬は、手動でdechorionate胚（必要に応じて）への胚の曝露を確保するため一時間ごとに洗浄を25％の段階的な一連の洗浄及びPBSTで50％メタノールで胚を脱水し、-20℃で100％メタノールに保存するするときに使用する準備ができて、10分ごとに、PBSTで50％（2回）および25％（1時間）、メタノールで洗浄してPBSTで胚を再水和する。最終的に100％PBSTで10分間ずつ2回洗浄する。正確なタイミングは、PBST /メタノール洗浄のために重要ではありません。 PBSTで10％の過酸化水素溶液中での漂白剤の胚は、必要に応じて、暗い色素を除去する。胚は、胚の年齢に応じて、10〜20分間過酸化水素溶液でインキュベートする必要があり、マイクロチューブのキャップは、空気の圧力の蓄積を防止するために開いたままにしてください 50 mg / mLのプロテイナーゼKでダイジェストの胚は、胚の年齢に応じて、3-15分間PBSTで1:5000に希釈その後、再修正の30分間、4％PFAで胚、および5分間ずつPBSTで3回洗浄パートII：リボプローブのハイブリダイゼーション （所要時間：3時間プラスハイブリダイゼーションのために一晩、1.5時間のパートIIIの翌日） 2〜3時間予熱した70℃の水浴中でプレハイブリダイゼーション溶液（PHS）で胚をプレハイブリダイゼーション 、PHSを取り除く70℃で一晩インキュベート0.5mLのハイブリダイゼーション溶液および1.5μL先に合成したジゴキシゲニン標識したリボプローブを、追加してください。温度は、リボプローブのターゲットに応じて数度以内に変動することができます翌日、70で胚を洗浄℃で10分間ごとに、2X生理食塩水、クエン酸ナトリウム（SSC）におけるPHS 75％、50％、25％の段階的なソリューションで、その後68℃30分間0.2 × SSCで洗浄° C 室温で10分間ずつのマレイン酸バッファー（MAB）2回で洗浄するパートIII：抗ジゴキシゲニン（α- DIG）抗体のインキュベーション （所要時間：3時間プラス第IV部に次の日、2.5時間をブロックするために一晩） 12ウェルプレートに胚を移す室温で少なくとも3時間は1-2 mlのブロッキング溶液中でプレブロックの胚同時に、このソリューションでブロッキング溶液の2番目のボリュームを準備し、抗ジゴキシゲニン抗体1:2000希釈して抗体を事前に遮断する事前にブロックを取り外し、事前にブロックされたα- DIGソリューション1〜2 mLを加え、4℃で一晩インキュベート翌日、MABで胚を洗浄する。胚は最初の5分間MABでインキュベートすることを許可し、バッファの変更を行うと、2つの10分、1 30分一​​60分間隔でインキュベートする。正確なタイミングは必要ありませんアルカリホスファターゼ（AP）バッファ内の胚の各5分間3回洗浄パートIV：染色と最終処理 （所要時間：1時間染色のための晩​​には、使用するリボプローブに応じて、グリセリンソープ、グリセリン洗浄あたり6〜10時間、の先頭に4時間はグリセロールに保存されていることがあります） 染色が十分になるまで、胚に1 – 2mLの染色液を追加箔でプレートをラップし、定期的な間隔（20分毎程度）で染色をチェック染色反応を停止するために各5分間PBSTで2回胚を洗うバックグラウンド染色を削除するには、その後100％メタノールで、PBSTで25％（1時間）と50％（2回）メタノールで10分間洗浄を使用して、胚を脱水する胚は、室温で少なくとも2時間、100％メタノールでインキュベートすることができます 50％で10分間洗浄（2回）および25％（1時間）PBSTでメタノールを使用して、PBSTで再水和する、その後100％PBST 2回洗浄ステンドメールを転送する4で段階的な一連の洗浄、およびストアを使用してPBSTで80％グリセロール溶液にmbryos、℃のレシピ： LB寒天プレート – 10 gのLB寒天+ 250mLの蒸留水、オートクレーブは、ときにタッチにクール各シャーレに15-20 mLの温溶液を注ぎ、250μLアンピシリンを追加、寒天が固化することができます LBブロス- 12.5 gのLB培地+ 200mLの蒸留水、オートクレーブは、使用前に冷却することができます 1％TAEゲル- 0.4 Gアガロース、40 mLの1X TAE、2μLのエチジウムブロマイド、負荷7μLプラスミドを（プラスミドcDNAターゲットの変換）または3μLリボプローブと4μLDEPC水（ その場 DIG標識RNAプローブの合成語 ）+ 1μLローディング色素、5μLのDNAラダープレハイブリダイゼーション溶液、50％ホルムアミド、5X SSC、9.2mMクエン酸、1％のTween – 20 ハイブリダイゼーション溶液プレハイブリダイゼーション溶液に加えて500μg/ mlとtRNAと50μg/ mlのヘパリン MAB – 100mMのマレイン酸、150mmの塩化ナトリウム、7.5〜0.2MのNaOH、0.1％のTween – 20、pHは MABでのブロッキング溶液、3部MAB、1部10パーセントベーリンガーブロッキング試薬、1部の熱は、子羊血清を非アクティブに 9.5〜APバッファ- 60mmのトリス- HCl pHは、60mmの塩化ナトリウム、30mMのMgCl 2を 、0.1％のTween – 20 染色液- 5 – ブロモ-4 – クロロ-3 – インドリルリン酸（BCIP）とのニトロブルーテトラゾリウム（NBT）APのバッファ 4。駐在結果正しく実行する場合は、NBT、BCIP、およびアルカリホスファターゼとの反応では、紫色の染色としてゼブラフィッシュ胚に表示される紫色の沈殿物を形成します。リボプローブは、以前は次の目的の遺伝子に対応するcDNAから合成する必要があります。したがって、それはあらゆる汚れを可視化が目的の遺伝子がその特定の発生段階で転写されているゼブラフィッシュの領域を表すと結論することができます。 fgf8a（Reifersら 、1998; 図2）。deltaC（オーツら、2005。）当コースの目的のために、リボプローブはaldh1a2（; Begemann ら、2001;図1以前raldh2）から合成された。 myod1（ワインバーグら、1996）; shha（。クラウスら、1993）、pax2a（ブランドら 、1996; 図 3）とmyl7（以前cmlc2;。Yelonら 、1999）cDNAを。染色は、正中線にし、体節、tailbud、筋節、脳、および心臓を含む解剖学的構造に期待されていた。Ace/fgf8a変異体は、これらの構造の多くの欠陥を持っていると予想された。染色が容易に標準的な解剖顕微鏡を用いて可視化した。 （Schoenwolf、2009。D'コスタリカら 、2009; Schmoldt ら 、2009年。クラーク、2003）その他の情報源はここに記載されたものと同様の手法をウィッシュについての詳細およびトラブルシューティングが含まれています。 aldh1a2のための特定のリボプローブとハイブリダイズされている図1。ゼブラフィッシュ胚24時間後に受精、。特定の染色は、目、後脳、胸びれ芽原基、および体節で見ることができます。前方の上部にある、後は一番下にあります。 図2。fgf8a用プローブの特異的にハイブリダイズされた開発の13体節期ではゼブラフィッシュ胚。特定の染色は、終脳、間脳背側、中脳後脳境界、体節、およびtailbudで見られます。腹側が左側に、背側は右側にあります。 図3。pax2a、神経系を可視化するための有用な堅牢なマーカーのためのリボプローブの特異的にハイブリダイズされた22時間後に受精のゼブラフィッシュ胚。特定の染色は、脈絡膜裂、中脳後脳境界、耳胞、および脊髄の神経細胞で見ることができます。左前方と背側ビュー。