使用全山原位杂交分子和有机体生物学链接

1。目标基因的质粒转化第一部分：质粒转化 （所需时间：3小时加孵育过夜） 暖SOC营养肉汤在42℃水浴（每秒500μL反应） 在冰上解冻胜任细胞加入1μL质粒25μL胜任细胞置于冰上20分钟在42℃水浴热休克细胞为45秒立即置于冰上2分钟的细胞每小瓶细胞加入500μL42℃的营养肉汤摇37 ° C为2小时每分钟旋转255（RPM） 板75μL卢里亚Bertani（LB）琼脂平板转型混合孵育板倒在37 ° C过夜第二部分：E大肠杆菌文化 （所需时间：15分钟加孵育过夜） 对于每一个反应，等分3 mL LB培养基中，并成为一种文化管3μL50 mg / mL的氨苄青霉素从琼脂平板刮1菌群，并添加到每个培养管摇文化管在37 ° C时，255个RPM过夜第三部分：质粒准备 （所需时间：1.5小时） 隔离质粒从过夜培养，使用5首相FastPlasmid试剂盒（产品编号2300000） 要检查准备质粒的存在，运行与溴化乙锭染色的1％的Tris -醋酸EDTA（TAE）凝胶洗脱试剂盒的DNA 司徒高辛标记的RNA探针合成2。 第一部分：线性质粒 （所需时间：2.5小时） 在1.5 ml离心管中，结合： 制备质粒 20毫升限制性内切酶* 2毫升缓冲区** 10毫升 10X牛血清白蛋白（BSA） 10毫升焦碳酸二乙酯（DEPC）水 58毫升 100毫升在37 ° C 2小时 *根据与质粒 **随限制性内切酶第二部分：转录 （所需时间：3小时） 在1.5 ml离心管中，结合： 线性质粒 4毫升 10X转录缓冲液** 4毫升地高辛标记组合 4毫升聚合酶* 2毫升核糖核酸酶抑制剂 2毫升 DEPC水 24毫升 40毫升在37 ° C孵育1小时加入2μL聚合酶* 在37 ° C孵育1小时加入2μL的DNA酶 37 ° 20分钟的彗星 *根据与质粒 **与聚合酶变化第三部分：降水 （所需时间：5分钟加2小时孵育过夜，1小时到离心机以及重新挂起） 加入4微升0.2M EDTA 添加5μL4M的氯化锂加入150μL冰冷的100％的乙醇在-80℃2小时孵育隔夜在4 ° C，倒出离上清在30分钟14000转的离心机干颗粒为7分钟再暂停20μLDEPC水 37 ° 5分钟第四部分：分馏 – 只有执行探头尺寸大于0.6 KB （所需时间：根据探头大小而定，一般不超过20分钟） 在1.5 ml离心管中，结合： RNA探针 20毫升 DEPC水 12毫升碳酸氢钠 4毫升碳酸钠 4毫升 40毫升在60℃水浴孵育。相应的方程的孵化时间： 时间（分钟）=（KB – 所需KB起）/（KB x 0.11 x开始所需KB） 平均所需的大小= 0.6 KB 第五部分：最后降水 （所需时间：5分钟犹特再加上2个小时的孵育过夜，1小时到离心机以及重新挂起，1小时凝胶电泳） 加入40μLDEPC水新增8μL醋酸钠添加1.04μL冰醋酸添加240μL，冰冷的100％的乙醇在-80℃2小时孵育隔夜在4 ° C，倒出离上清在30分钟14000转的离心机干颗粒为7分钟再暂停20μLDEPC水涡旋混合要检查的riboprobe存在，用溴化乙锭重悬的解决方案上运行了1％TAE凝胶染色 3。 原位杂交技术在全山第一部分：固定的胚胎和蛋白酶K消化 （时间要求：固定过夜，加上4小时的存储的第二天，2.5小时从存储到第二部分） 收集上演斑马鱼的胚胎，并固定在4％多聚甲醛（PFA），4℃过夜° C 洗净的磷酸盐缓冲液固定胚胎，含有0.1％，每次10分钟吐温20（PBST）的3倍为了确保胚胎暴露于实验试剂，手动dechorionate胚胎（如有必要），用细尖镊子脱水洗衣机梯度为25％和50％PBST甲醇一小时每次洗的胚胎，然后将其存储在100％的甲醇，在-20 ° C 准备使用时，补充水分在50％（2次）和25％（1次），每次10分钟PBST甲醇洗涤的胚胎在PBST。最后在100％PBST洗，每次10分钟的2倍。 PBST /甲醇洗涤的确切时间并不重要死神胚胎在PBST 10％的氢过氧化物的解决方案，如果有必要，消除黑暗的颜料。胚胎中的过氧化氢溶液中孵育10-20分钟，取决于胚胎的年龄，和离心管帽应保持开放，以防止空气压力建立精华与50 mg / mL的蛋白酶K的胚胎在PBST稀释1:5000为3-15分钟，根据胚胎的年龄重新修复的胚胎在4％，煤灰30分钟，然后在PBST洗3次，每5分钟第二部分：Riboprobes杂交 （所需时间：3小时加杂交过夜，1.5小时，第二天第三部分） Prehybridize与预杂交液（小灵通）在70℃水浴预热2-3个小时的胚胎取出小灵通，加入0.5毫升的杂交液和1.5μL，以前合成的地高辛标记riboprobes，在70℃过夜孵育。温度内波动取决于几度riboprobe目标第二天，洗胚胎在70 ° C的75％，50％，25％和2倍生理盐水，每次10分钟的柠檬酸钠（SSC），小灵通分级的解决方案，然后洗为30分钟，在0.2X SSC在68 °彗星洗净，每次10分钟，在室温下马来酸缓冲器（MAB）的2倍第三部分：（α- DIG），抗地高辛抗体孵育 （所需时间：3小时加通宵块，2.5小时，第二天第四部分） 胚胎转移到12孔板在封闭液1-2毫升块前胚胎在室温下至少3小时同时，前块在此解决方案，准备第二卷的封闭液和稀释的抗地高辛抗体1:2000的抗体删除前块，加1-2毫升预先阻止α- DIG解决方案，孵育过夜，在4 ° C 第二天，在人与生物圈洗的胚胎。允许胚胎孵化在人与生物圈计划第一次为5分钟，然后执行缓冲区的改动和孵化为两个10分钟，30分钟和60分钟的时间间隔。确切的时间是没有必要的的洗净胚胎碱性磷酸酶（AP）的缓冲区每5分钟的3倍第四部分：染色和最后的处理 （所需时间：1小时染色过夜，取决于使用riboprobe，可以存储在甘油甘油洗涤，每甘油洗6-10小时，开始4小时） 胚胎染色溶液加入1-2毫升，敷箔板，并检查定期（约每20分钟一班）染色，直到染色就足够了用PBST 2次，每次5分钟洗净胚胎停止染色反应 10分钟的清洗（1次）在25％和50％（2次）PBST甲醇，然后用100％甲醇脱水胚胎，以消除背景染色允许胚胎孵化在室温下至少2个小时，在100％甲醇补充水分在使用10分钟的洗涤，在50％（2次）和25％（1次）甲醇在PBST PBST，然后洗净PBST 2次100％ 转移染色Ëmbryos PBST在80％的甘油溶液，使用的清洗和存储的分级系列，4 ° C。 食谱： LB琼脂平板上，10克的LB琼脂+ 250 mL蒸馏水中，高压灭菌，冷却到触摸时添加250μL，氨苄青霉素，每个培养皿倒入15-20毫升温暖的解决方案，使琼脂凝固 LB肉汤12.5克LB肉汤200毫升蒸馏水中，高压灭菌器，让冷却后再使用 1％TAE凝胶，40毫升1X TAE 2μL，溴化乙锭0.4克琼脂糖;负载7μL的质粒（质粒转化目标基因）或3μLriboprobe和4μLDEPC水（ 原位 DIG标记的RNA探针合成） + 1μL上样染料，5μLDNA梯状预杂交解决方案的50％甲酰胺，5X SSC，9.2mM柠檬酸，1％Tween – 20的杂交液，预杂交液加500μg/ mL的tRNA和50微克/ ml肝素马来酸人与生物圈- 100MM，150MM氯化钠，0.2M氢氧化钠，0.1％Tween – 20的pH值至7.5 封闭液3部分人与生物圈计划，第1部分的10％勃林格阻断试剂，在人与生物圈计划，第1部分热量停用羔羊血清 AP缓冲60MM的Tris – HCl pH值至9.5，氯化钠60MM，30MM MgCl 2的 ，0.1％Tween – 20的染色液5 – 溴4 – 氯-3 – 吲哚磷酸（BCIP）和硝基蓝四氮唑（NBT）在AP的缓冲区 4。代表性的成果正确执行时，NBT，BCIP和碱性磷酸酶之间的反应将形成一个紫色的沉淀，应该对斑马鱼的胚胎出现一个紫色的污点。 Riboprobes应以前合成的cDNA对应感兴趣的基因。因此，可以断定任何污点的可视化表示感兴趣的基因的斑马鱼已经在那个特定的发展阶段的转录。对于这门课程的目的，riboprobes合成aldh1a2（以前raldh2; Begemann 等，2001;图1）; fgf8a（Reifers等 ，1998; 图 2）; deltaC（奥茨等人，2005年）; myod1（温伯格等人，1996年）; shha（克劳斯等人 ，1993年），pax2a（品牌等，1996;图3）和myl7（以前cmlc2。Yelon等 ，1999）的cDNA。染色预计在中线和包括体节，tailbud，肌节，脑，和心脏的解剖结构。Ace/fgf8a突变预计将有许多这些结构上的缺陷。染色轻松地可视化，使用标准的解剖显微镜。其他来源包含更多的信息，对拟到这里描述的类似的技术和故障排除（克拉克，2003年，德科斯塔等人，2009; Schmoldt 等 ，2009; Schoenwolf 2009年）。 图1：斑马鱼的胚胎24小时受精后，已与特定riboprobes为aldh1a2杂交。特殊染色可以看出眼睛，后脑，胸鳍芽原基和体节。前路是到顶部，后是到了谷底。 图2：在13体节期的发展已为 fgf8a探头具体杂交斑马鱼的胚胎。特殊染色可见在端脑，间脑背侧，中脑，后脑边界，体节，和tailbud。腹是向左，背是正确的。 图3一个22小时受精后斑马鱼的胚胎已与pax2a，一个强大的标志，有助于神经系统的可视化riboprobe具体杂交。可以看出，在脉络膜裂，中脑，后脑边界，奥迪囊泡，和脊髓神经元特异性染色。背视图与左前方。