Micropatterned 세포를 사용하여 약물의 영향 향상된 시각화 및 정량 분석

1. Micropatterns에 세포 준비 및 심는 플레이스 6 잘 접시 2 독립 웰스 2 CYTOOchips 당신이 CYTOOchip의 오른쪽 하단 모서리에있는 'CYTOO "를 읽어 있도록. Micropatterns는 찬란 Cy3 또는 Cy5 염료로 분류하실 수 있습니다. 본 실험에 사용 CYTOOChips은 Cy3 찬란 micropatterns를 분류했습니다. 주의 : 어둠 속에 칩을 보관하십시오. trypsinization로 헬라 세포를 (~ 80 %의 합류)를 수집합니다. 세포가 제대로 트립신 처리에 의해 분산되는 현미경으로 확인합니다. 4 분에 대한 300g에 세포를 수집하고 원심 분리기, 부드럽게 세포 펠렛을 resuspend. 세포를 카운트하고 15,000 세포 / 완료 DMEM/F12 문화 매체 ML의 농도로 희석. 잘 CYTOOchip을 포함하는 각각에 4 ML (60,000 셀)을 분배. 주의 : 접시는이 센터에서 세포를 집중하는 경향이 있으므로 중간에 회전 움직임을 유도 피하기 위해 가능한 한 작은으로 이동해야합니다. 후드 아래에 10 분에 대한 세포의 침전물은 다음 세포 배양기로 움직여. 10-20 분 후, 세포가 micropatterns을 준수하기 시작합니다. 10 분 후, 현미경으로 정기적으로 확인하십시오. 최대한 빨리 세포가 첨부로 세포 매체를 변경하고 부드럽게 다음 절차를 사용하여 coverslip 표면을 플러시 : 접시 평면 유지하는 것은, 부드럽게 잘의 측면에서 피펫으로 매체를 대기음. 주의 : 칩 건조 사라지게하지 않을,이 모든 액체를 대기음 없지만 항상 CYTOOchip을 감추기에 충분 할만큼 떠나지 않을 것을 의미합니다. 4 ML PBS를 추가하고 처음엔 잘 측면으로 이동 칩의 중심에서 시작 다시 대기음. 공기에 칩을 노출하지 않고 설명으로 PBS를 대기음. 3-4 회 반복합니다. 부유 세포에 대한 현미경 검사 : 부동 세포의 다수가 남아있는 경우, 세탁 절차를 반복합니다. 당신은 거의 세포를 볼 경우, PBS의 일부를 대기음 2 ML 신선한 매체로 바꾸십시오. 기음과 두 번 신선한 중간 4 ML를 추가합니다. ° C 3 시간 최소 5 % CO 2 세포가 확산 전체를 달성하기위한 수 있도록 37 조직 문화의 인큐베이터에서 접시를 놓습니다. 참고 : micropatterns가 하나 또는 여러 개의 셀을 차지하는 것입니다 10~30% (2000-6500) 사이에이 방법을 사용합니다. 주의 : 세포 세탁 단계와 micropatterns에 대한 세포의 확산 것은 각각의 세포 라인에 특정 것입니다 전체에 필요한 시간 전에 준수해야하는 데 필요한 시간. 2. Blebbistatin 트리 트먼트 17 mm의 주식 솔루션을 얻기 위해 100 % DMSO에 blebbistatin를 해산. 100 % DMSO 5 mm까지 추가로 주식 솔루션을 희석. 0.1 % DMSO에 5 μm의의 blebbistatin의 최종 농도를 얻을 문화 매체의 최종 희석하십시오. 제어 조건, 단 0.1 %의 DMSO를 포함하는 중간 4 ML을 준비합니다. 세포에있는 미디어를 기음과 치료 및 제어 조건 준비 4 ML 매체로 바꾸십시오. 37 1 시간에 대한 품어 세포 ° C. 3. 세포 고정과 굴지의 스테 이닝 세포 고정을위한 솔루션 준비 cytoskeleton 버퍼 (CB) 및 PFA 5 % 준비를위한 시약 섹션을 참조하십시오. CB는 특히 굴지의 필라멘트와 microtubules의 형광 라벨을 권장합니다. 1xCB – 자당 준비 : CB 2 ML에 자당의 1g을 추가합니다. 자당의 포함은 내부 세포 구조를 유지하는 데 도움이됩니다. PFA – CB – 자당 4 % 준비 : 따뜻한 PFA 5 % 4 ML에 1xCB – 자당 1 ML을 추가합니다. 주의 :이 솔루션은 4 ° C 단 몇 일 동안 보관하실 수 있습니다. PFA의 고정 4퍼센트 PFA – CB – 자당 솔루션 2 ML을 포함하는 6 자 판의 우물 (세탁 제외) CYTOO 로고와 장소를에 CYTOOchip 데리러 포셉를 사용하여 RT 10 분 알을 품다 PFA – CB – 자당을 제거하고 PBS로 한번 씻어 잔여 PFA의 crosslinking 활동을 담금질하기 위해 10 분 100 MM NH 4 Club 호텔 2 ML과 함께 두 번째 세척을 참고 : PFA 고정 슬라이드가 4 며칠 ° 형광 이미징을위한 organelle의 얼룩하기 전에 C에 대한 PBS에 저장할 수 있습니다. 트리톤 X – 100 세포막의 Permeabilization 세제로 세포의 Permeabilization는 항체 또는 기타 프로브는 세포막에 침투 수 있으며 그렇지 않으면 어려운 자신의 로컬 리 제이션을 분석할 수 있도록 cytoskeletal 폴리머의 대비를 줄일 수 cytoskeleton의 단백질의 cytosolic 수영장의 일부를 제거합니다. RT 3 분 NH 4 Club 호텔을 제거 2 ML 추가 / 우물의 0.1 % 트리톤 X – 100 – CB 2 ML PBS로 두 번 씻어 굴지의 얼룩 형광 – phalloidin있는H는 기본 굴지에 바인딩은 굴지의 필라멘트를 얼룩하는 데 사용됩니다. 1.5 % BSA와 PBS에서 1:2000 희석 FITC – 복합 phalloidin 2 ML 추가 RT에서 품어 1 H 2 ML PBS로 한번 씻어 핵의 얼룩 (PBS에 1μg / ML로 얼룩) Hoechst 2 ML 추가 RT 3 분 알을 품다 2 ML PBS로 2 번 씻어 슬라이드 마운트 25-30 Mowiol의 μL 또는 기타 장착 솔루션을 사용하여 표준 현미경 슬라이드에 CYTOO 로고와 마운트 CYTOOchip에 CYTOOchips를 선택하십시오. 4. 현미경의 설치 및 자동 이미지 수집 많은 이미징 소프트웨어 패키지는 제어 빠른 자동 이미지 수집 및 표시에 대한 현미경 존재합니다. 이 예제는 Metamorph 이미징 소프트웨어와 자동 인수는 CCD 카메라와 하마 마츠 Intensilight 수은 섬유 조명기 장착된 니콘 이클립스 티 현미경에서 수행을 사용합니다. 이미지 DAPI (핵), 싸이 – 3 (micropatterns)와 FITC – Phalloidin (굴지)에 해당하는 세 파장의 20x 확대에 인수됩니다. micropatterns의 숫자는 카메라와 목표의 설정에 따라 달라집니다 분야마다 시각. CYTOO의 micropatterns 크게 인수를 촉진 칩 전체 (100 또는 130 μm의) 서로 정의된 간격으로 위치하고 있습니다. 20x 확대를 선택합니다 오픈 다차원 수집 (메뉴 막대에 : 애플 리케이션 / 다차원 취득)과 실험의 다양한 매개 변수를 설정 : 파장 수 : 3 파장 유형 : DAPI, FITC, Cy3 최초의 세포의 분야에 초점을하여 각 파장에 대한 노출 시간을 설정 자동 초점은 각 파장에서 수행할 수 데이터를 저장할 위치를 선택하십시오 12 micropatterns는 시각과 카메라 분야 (4 열 및 패턴 3 행) 중심으로 수 있도록 Cy3 파장과 위치 카메라를 선택합니다. 다차원 취득을 실행하는 일기를 만듭니다. 일기 작성을위한 절차는 그림 1에 설명되어 있습니다. 오픈 스캔 단계 기능 (메뉴 막대에 : 장비 / 무대 / 스캔 스테이지). 20x 확대 24 이미지가 포함된 각 12 micropatterns를 얻기위한, -400 μm의 X 단계의 크기 300 μm의의 Y 단계 크기, 6 열 4 행을 입력합니다. 실행으로 설정 저널에서 저널 MDA.JNL을 업로드할 수 있습니다. 다음 세 가지 파장의 전체 블록의 자동 수집을 시작하는 스캔을 누르십시오. 참고 : 단계 크기는 여기에 표시된 X와 Y가 카메라 분야에서 현재 micropatterns의 개수에 따라 달라집니다. 올바른 방향으로 운동에 대한 부정적인 가치를 요구할 수 있습니다 당신의 단계에 따라이 X 및 / 또는 Y에서 방향을 설정합니다. 5. 자동 이미지 처리 및 분석 많은 이미지 처리 및 분석 소프트웨어 패키지는 존재합니다. 절차는 아래 개요 이미지 프로세싱과 오픈 소스 프로그램 ImageJ용으로 작성된 사용자 지정이 만든 매크로가 수행 분석 단계를 설명했다. 첫 번째 매크로 CellRef가 참조 셀, 세포막의 두 번째 Hypotenuse 대책 강성 / 축소를 만듭니다. 모두를 통해 요청할 수 있습니다 www.cytoo.com . micropatterns (매크로 CellRef)을 중심으로 세 가지 채널에 대한 이미지 스택을 만듭니다. micropatterns의 이용은 크게 현지화 및 개별 세포의 세분화는 자동 영상 처리의 첫 단계를 단순화, 셀 클러스터링 및 clumping을 방지합니다. 찬란 표시 micropattern 이미지는 micropatterns을 중심으로 지역을 정의하고 구분하는 데 사용됩니다. 이 지역은 다음 다른 채널에서 가져온 이미지로 바뀜과 먹죠. 해당 자른 이미지는 다음 각 파장에 대해 스택에 조립합니다. RGB – 스택은 또한 세 가지 채널 (그림 2)의 병합에서 만들어집니다. 하나의 셀 선택 필터 (매크로 CellRef)을 적용 위의 지적으로 남은 micropatterns가 비어있는 동안, micropatterns의 10-30% (2000-6500)는, 단일 셀 또는 여러 세포에 의해 점유하고 있습니다. 단 하나의 세포에 의해 점유 micropatterns을 표시 이미지를 선택하려면, 매크로 이미지마다 핵의 숫자를 감지하여 모든 스택 (RGB하고 다른 파장)를 포함 하나 이상의 핵 또는 전혀 핵 (그림 3)에서 제거합니다. 정규화되지 않은 완전히 셀 영역 컷을 해제 사용하는 필터 (매크로 CellRef) micropattern 가로질러 뻗어되지 않습니다 세포 제거 하려면 핵 필터를 탈출했을 세포, 굴지에 대한 FITC 채널을 사용하여 다른 필터를 분리 제거가 적용됩니다. 셀 영역은 계산하고 특정 컷 오프 (이하 계면 셀 면적보다 2 배에 대한 세포 분야) 아래 그 모든 스택에서 제거됩니다. 셀 봉투 영역은 패턴의 크기에 의해 결정됩니다. <li> (매크로 CellRef) 셀 이미지 정렬 이전 단계에서 단일 micropatterned 세포를 포함하는 이미지가 선택되었습니다. 이러한 이미지가 micropatterns 중심으로에도 불구하고, 그들 모두는 완벽하게 서로 정렬 적이 없습니다. 이미지 처리, ImageJ 플러그인 (MultiStackReg)를 체결하려면 micropattern 위치를 기반으로 모든 수집된 이미지와 모든 채널을 재개하는 적용됩니다. 이 단계는 이제 참조 세포의 단일 세포 분석 또는 작성 (그림 4)에 사용할 수있는 개별 이미지의 정렬 스택을 생성 참조 셀 (매크로 CellRef)를 구축 micropatterns에 성장하는 세포는 모든 세포와 비슷한 모양을 가지고 것을 의미합니다. 이 정규화는 여러 셀 이미지의 정확한 정렬 및 오버레이를 허용합니다. 전체 스택이 지남에 따라 각 이미지의 신호를 합산하면 하나가 "에 관한 약물 효과"를 시각화하고 평가할 수 있습니다. 최종 전체 이미지 또는 참조 셀은 표현과 이미지 분석을위한 독특하고 유용한 도구입니다 단 micropatterned 세포 (그림 4)로 구할 수 있습니다. ImageJ에서 참조 전지는 스택에서 필터링 및 정렬 이미지의 투영함으로써 구성되어 있습니다 (이미지> 스택스> Z – 프로젝트). 몇 가지 프로젝션 방법은 같은 평균이나 최대 강도로 적용할 수 있지만 일반적으로 중간 프로젝션은 이미지 스택의 주요 outliers을 제거하는 선택됩니다. 결과 심사를 촉진하기 위해 색상 코드 주파수지도로 monocolor 이미지를 변환 LUT는 (테이블을 조회) 적용됩니다. 관심의 매개 변수 (매크로 Hypotenuse)를 측정하고 quantifying 양식이 하나의 주요 스트레스 섬유에 굴지의 cytoskeleton를 실시하고 있기 때문에이 비디오 문서에서는 L – micropatterns이 사용됩니다. 이런 방식으로 굴지 강조함으로써, cytoskeleton에 blebbistatin의 영향은 여러 가지 방법으로 확인할 수 : 또는 스트레스 섬유의 강도, 길이 또는 두께 얼룩 굴지 스트레스 섬유의 굴절률이 변화하고, 굴지의 필라멘트의 morphometric 기능의 변화를 측정 셀 모양 등은 이러한 매개 변수는 개별 셀 이미지 또는 최종 참조 셀 자체에 어느 측정할 수 있습니다. 여기, 5 μm의 제품 blebbistatin의 영향은 두 번째 ImageJ 매크로 (그림 7) Hypotenuse라는 이름을 사용하여 붕괴 세포의 수를 세어 특징했다. 간단히, L – micropattern의 thresholded 이미지는 셀 삼각형 모양의 이론적 hypotenuse을 정의하는 데 사용됩니다. 다음 굴지의 스테인드 이미지 thresholding는 대략적인 실제 셀 모양을 위해 수행됩니다. 세포 삼각형과 실제 오목 세포막의 이론 hypotenuse 사이의 영역은 다음 측정됩니다. 세포가 붕괴되면, 이론적 hypotenuse 아래 영역이 나타납니다. 붕괴 세포의 비율 제어를 비교하는 데 사용 조건을 처리됩니다. 6. 대표 결과 어떤 세포의 예로는 바로 micropatterns에 모습이어야하며 1.6-1.8에서 설명하는 중요한 세척 단계 후 몇 시간은 그림 5에 표시됩니다. CYTOOchips에서 15 분 후, 둥근 헬라 세포들은 fibronectin micropatterns (그림 5A)을 준수한다는 의미 같은 거리에서 관찰하고 있습니다. 세포 문화 선박의 부드러운 흔들림에도 불구하고 고정 남아있는 경우 접착이 완료되었습니다. 여러 세포에 의해 점령 micropatterns의 수를 최소화하기 위해, 과자는 다음 cytophobic 영역을 통해 부유 세포를 제거하는 PBS로 플러시됩니다. 몇 시간 후, 완전히 micropatterns 끌었 아르 세포는 그림 5B에 표시된 사람처럼 보이게됩니다. blebbistatin, 고정 및 굴지과 핵의 얼룩과 세포의 배양 후 얻은 전형적인 단일 셀 이미지는 그림 6에서 제공됩니다. 여러 이미지와 ImageJ CellRef 매크로를 사용하여 영상 처리의 자동 취득 후, 색상 코딩된 주파수지도 굴지의 강도 모든 세포 이미지 (6C 6F 및 그림)를 통해 평균을 묘사되는 생성됩니다. nontreated 및 취급 조건을 참조 셀의 비교 연구에서 표현형 쉽게 관찰하기 위해이 방법의 가능성을 보여줍니다 및 셀룰러 약물 효과를 탐험 특히 유용합니다. 세포에 blebbistatin의 효과 중 하나가 가능한 분석의 예제는 그림 7에 표시됩니다. 붕괴 세포의 번호 (이론 hypotenuse에 따라 기존의 빈 공간 ie. 전지) 50 컨트롤 세포에 감지하고 ImageJ의 Hypotenuse 매크로에 의해 감지는 5 μm의의 blebbistatin 대우 50 전지가 표시됩니다. blebbistatin 취급 인구의 붕괴 세포의 증가 숫자는 스트레스 섬유 세포 내에 수축성 actinomyosin 세력의 blebbistatin 억제로 인한 세포막에 따라서 긴장의 이완을 반영합니다. 그림 1. Metamorph으로 새 저널을 만드는 방법. </P> 자동 이미지 처리 절차의 그림 2. 플로우 차트. 그림 3. 단일 세포 밖으로 필터링. 그림 4. 참조 셀 구축. 그림 5. 세포 시딩. A) 헬​​라 세포는 B) 헬라 세포 내 micropatterns (10X 배율)에 퍼지는 전체 이후 플러싱 단계 (4X 배율) 이후 micropatterns을 준수. 그림 6. 컨트롤과 약물 치료 조건에 nonpatterned 및 micropatterned 세포의 비교. 헬라 세포는 3 시간 동안 씨앗 5 μm의의 1 시간 blebbistatin (하단 패널) 또는 왼쪽 치료 (패널 위)와 치료를했다. 제어 nonpatterned 세포 (A)에서 굴지 5 μm의의 blebbistatin (D) 치료시 눈에 보이지 분해 여러 섬유로 조립. L – micropatterns에서 제어 세포가 삼각형 모양 (B)를 채택하고 nonpatterned 세포 (D)에 비해 L.의 2 apices 사이의 주요 굴지 섬유 (스트레스 섬유)를 개발, blebbistatin는 L – micropatterned에 중요한 phenotypic 변화를 유도 전지 (E). 약물 효과와 제어 및 처리 조건의 비교 직접 시각화는 20 세포에서 만들어진 참조 셀 프레 젠 테이션으로 신속하게 시각하실 수 있습니다. blebbistatin는 세포의 붕괴와 주요 스트레스 섬유가 사라집니다 (F)를 처리하는 동안 각각의 세포와 마찬가지로, 명확하고 강한 스트레스 섬유, 제어 참조 셀 (C)에 존재합니다. 그림 7. 매크로 Hypothenuse를 사용하여 세포에 blebbistatin의 효과 분석의 예. 제어 세포의 25 %가 붕괴 동안, 이것은 약화 actinomyosin 수축성 네트워크 (N = 50 세포)를 반영 5 μm의의 blebbistatin 치료 세포를 75 %로 3 배 증가했습니다.