Кристаллизация Мембранные белки в липидных Мезофазы

Типичный контур в эксперименте кристаллизации мезо показано на рис.1 1,2. Предварительно кристаллизации LCP-FRAP анализы не являются обязательными, однако, они могут значительно ускорить процесс поиска начальных условий кристаллизации, особенно в случае сложных белков мембраны 3. 1. Белки Восстановление в КСУ Purify мембранного белка интереса к моющим раствором и сосредоточиться белка / моющего средства комплексов до ~ 10 – 20 мг / мл, заботясь, чтобы не за-концентрат 1,4 моющего средства. Передача ~ 25 мг LCP липидного хоста (как правило, моноолеина) или липидные смеси в 1,5 мл пластиковая трубка и инкубировать при температуре 40 ° С в течение нескольких минут, пока липидного расплавов. Прикрепите шприц переходник для 100 мкл газонепроницаемый шприц. Нагрузка шприц с расплавленным липидного использованием регулируемой пипетки объемом. Запись объема липидов в шприц. Нагрузка еще 100 мкл шприц раствор белка в растворе белка-на-липидный соотношение 2 / 3 В / В. Подключите оба шприцы вместе через шприц муфты. Нажмите шприц плунжеров попеременно двигаться липидов и белков через внутреннюю иглу ответвитель, назад и вперед, пока липидного мезофазы становится однородным. LCP формы спонтанно после механического перемешивания, а белок становится воссоздана в липидный бислой LCP. Формирование КСУ может быть проверена путем ее прозрачной и гелеобразной консистенции и из-за отсутствия birefringency, если смотреть под микроскопом оснащен кросс-поляризаторы, или, если возможно, с помощью малоуглового рентгеновского дифракционного 1. 2. LCP-FRAP предварительной кристаллизации Анализы LCP-FRAP тесты предназначены для измерения свойств диффузии мембранных белков воссоздана в КСУ в различных условиях скрининга 3. Дальний диффузии мембранных белков в КСУ имеет важное значение для успешной кристаллизации, однако, микроструктуры LCP ограничивает диффузию больших белков или олигомерных агрегатов белка. Распространенная причина провала в эксперименте кристаллизации мезо это быстрый агрегации белков приводит к потере диффузии. Было показано, что агрегация поведение белка зависит от конкретного построить белка, липидов и хост состав скрининга решение 3. Этикетка белок с флуоресцентным красителем (Cy3 или подобный) на белок / краска отношение ~ 100 / 1, удаления непрореагировавшего красителя и концентрат белка до ~ 1 мг / мл. Этикетка либо бесплатно, амины или бесплатно тиолов. При маркировке свободных аминов, использование рН между 7 и 7,5 до преимущественно этикетке свободных N-конца. Помните, что аминокислоты маркировки может также этикетки липидов совместно с очищенным белком 2,3. Развести меченых белков в КСУ, как описано в разделе 1). Настройка анализа пластин, как описано в разделе 3), используя LCP-FRAP решения скрининга вместо кристаллизации экраны 2. Инкубируйте пластин при 20 ° С в темноте в течение не менее 12 часов для достижения равновесного состояния. Разместите один из пластин на LCP-FRAP станции и сосредоточиться на первой скважины использовании 10x цели. Приобретать 5 флуоресцентные изображения для захвата начальной предварительно просветленного состояния. Триггер лазера. Мощность лазера и количество импульсов должна быть скорректирована, чтобы отбелить ~ 30 – 70% меченого белка в середине беленой месте. Сразу же после запуска лазера, начать запись быстро после отбеливания последовательность ~ 200 изображений в максимально возможной скоростью. Следуйте с записью медленный после отбеливания последовательность ~ 50 изображений, выбор задержки между снимками, как 1-20 с, в зависимости от скорости диффузии белка. Интеграция интенсивности внутри отбеливателя место во всех кадрах и исправить ее для отбеливания и световую интенсивность колебаний при приобретении путем деления интенсивности внутри беленой пятно усредненная интенсивность ссылкой месте за пределами лазерной беленой области. Нормализация исправлены интенсивности, чтобы предварительно отбеленной интенсивности равны 1, а начальная беленой интенсивность равна 0. Fit кривой нормированной интенсивности в зависимости от времени, F (т), по следующей формуле 5: F (т) = М х ехр (-2Т / т) х (я 0 (2Т / т) + I 1 (2Т / т)), (Eq.1) где М мобильных долю диффундирующих молекул, T-характерное время диффузии, т есть реальное время каждого записанного кадра, I 0 и I 1 в 0-й и 1-го порядка модифицированные функции Бесселя. Вычислить коэффициент диффузии, D, как: D = R 2 / 4Т (Eq.2) где R-радиус беленой месте. Перемещение то следующем хорошо и повторите шаги 2,5) – 2.13). Сравнить мобильный фракций и коэффициентов диффузии, полученные для различных условий отбора. Дизайн новой кристаллизации экранов на основе компонентов, которые облегченной диффузии белка и без учета условий, при которых белок диффузии не наблюдалось. Если белка не диффундируют в любом из экранированных условиях, рассмотреть вопрос о расширении пространства скрининга или пытаются построить новый белок. 3. Настройка LCP Испытания Кристаллизация Развести белка в КСУ, как описано в разделе 1). Передача белка нагруженные LCP в 10 мкл газонепроницаемый шприц прилагается к повторяющимся диспенсер шприц. Прикрепите короткое съемной иглой (калибр 26, 10 мм длина) до 10 мкл шприц. Внесите 200 нл болюсов LCP на поверхности четырех соседних скважин формирования квадрат 2х2. Наложение каждого из болюсов КСУ с 1 мкл соответствующего решения экране кристаллизации. Cap четыре загружены скважин с 18 мм квадратных покровного стекла. Применить мягкое давление на покровное для герметизации скважин. Повторите шаги 3.4) -3,6) со следующим набором 4 скважины, пока вся пластинка будет заполнен. Инкубируйте планшет при постоянной температуре, периодически проверяя образования кристаллов и роста. 4. Сбор кристаллов из LCP Место пластина с кристаллами белка под стерео микроскоп с переменным увеличением, оснащен линейными вращающимся поляризатором и анализатором. В центре внимания также интерес использование низких трансфокации так что все хорошо помещается в поле зрения. Оценка покровного стекла в четыре удара решения квадратных внутри и границы использования острый угол керамического капиллярного резки камня. Пресс всему периметру забил с сильным острым пинцетом точки для распространения через царапины толщина покровного стекла. Удар два маленьких отверстия на противоположных углах квадрата забил. Inject несколько мкл осадителя раствора через одно из отверстий, чтобы уменьшить обезвоживание во время последующих шагов. Использование угловой резкое зонда иглы разбить стекло вдоль одной или двух сторон, чтобы освободить выреза площади. Аккуратно поднимите смотреть стекло квадрат для кубических болюсного фазу. Если болюсного прилипла к покровным, затем переверните стекло квадрат снова и место на дне колодца. Добавить дополнительные несколько мкл осадителя решения, дополненные крио-защитное, в случае необходимости, на вершине подвергается кубических болюсного фазы в скважине. Увеличение увеличением микроскопа и сосредоточиться на кристалле. Отрегулируйте угол между поляризатором и анализатором, чтобы увеличить контраст между двулучепреломляющих кристалла и фона, сохраняя при этом достаточно света, чтобы увидеть уборки петли. Выберите MiTeGen MicroMount с диаметром соответствующий размер кристалла, а затем урожай кристалла непосредственно из КСУ по черпая ее в MicroMount. Flash Freeze MicroMount с собрано кристалла в жидком азоте, и отправить ее в beamline синхротронного источника рентгеновского сбора данных 6. 5. Представитель Результаты: Инженерии человека бета-2 адренергические G-белком рецептор (β 2-АР T4L) была высказана в бакуловирусной инфицированных Sf9 клетках насекомых и очищенный в dodecylmaltoside (DDM) / гемисукцинат холестерина (ХС) раствором моющего средства связаны с частичным обратным агонистом carazolol 7. Белка была помечена Cy3 эфир NHS и используются в LCP-FRAP предварительной кристаллизации анализы (рис. 2). Грубые экранов сетка основана на нескольких условиях, выбранных по результатам LCP-FRAP анализы производятся начальные кристаллические хитов (рис. 3). Дальнейшая оптимизация осадителя условия дали дифракции качество кристаллов (рис. 4). Рисунок 1. Блок-схема типичного эксперимента кристаллизации LCP. Шаги в серые коробки, не описанных в текущих протоколов. Рисунок 2. LCP-FRAP пробы с β 2 AR-T4L/carazolol в моноолеина основан LCP. ) Результаты LCP-FRAP анализ выполняется в автоматическом высокой пропускной режим, в котором каждый образец 96-луночного планшета отбеливается последовательно и флуоресценции восстановления измеряется после 30 мин инкубации. Получить флуоресценцию возмещений, которые представляют собой мобильные долю в каждом образце, построены для всех 96 образцов. Скрининга растворы содержат 0,1 М Трис рН 8, 30% об. / ПЭГ 400 в сочетании с 48 различных солей в двух различных концентрациях. Б) восстановления флуоресценции профилей для нескольких репутацияставителем условиях. Сплошные кривые линии представляют подходит уравнением. 1.The мобильных фракций и коэффициентов диффузии определяются по формулам. 1 и 2. Быстрое восстановление менее 10% в образце, содержащем хлорид натрия связано с флуоресцентно меченных липидов совместно с очищенным белком. Рисунок 3. Первоначальные хитов кристалла β 2 AR-T4L/carazolol получен грубый отбор сетку вокруг наиболее перспективные условия, определенные LCP-FRAP, содержащих Na сульфат (панели) и Na Формиат (группа В). Белок помечены Cy3 эфир NHS и флуоресцентные изображения, сделанные с использованием возбуждения при 543 нм и эмиссии при 605 нм. Рисунок 4. Оптимизированная кристаллы β 2 AR-T4L/carazolol. Изображения кристаллов, выращенных в присутствии сульфата натрия (панели и В) и К Формиат (панели C и D) берутся в режиме светлого (панели и С) и с помощью кросс-поляризаторов (панелей B и D).