Sviluppo di ovaio di criceto cinese-dosaggi delle proteine ​​della cellula ospite con la tecnologia Acoustic microparticelle di membrana

1. Microparticelle di preparazione Anticorpi etichette con Biotina NHS Chimica Determinazione del grado di biotinilazione Perle streptavidina coniugato con anticorpo biotinilato Risospendere le sfere nel flacone originale con il vortex per 1-2 minuti Aliquota il volume desiderato di perline in una provetta Lavare le perle 3 volte con PBST: Collocare la provetta contenente le perline sul magnete per 2 minuti Eliminare il surnatante tramite aspirazione con il tubo sul magnete. Fare attenzione a non disturbare le perline Togliere la provetta dal magnete e aggiungere 1 ml PBST Vortex per 20 secondi per risospendere le sfere Centrifugare per 5 secondi per rimuovere le perle dal tappo Ripetere altre due volte 2.3.1-2.3.5 Dopo il terzo lavaggio posto il tubo sul magnete e aspirare il PBST Aggiungi anticorpo biotinilato ai talloni, risospendere Se necessario, portare il volume delle anticorpo biotinilato fino a 300 ml con PBS. Se il volume anticorpo è già superiore a 300 ml non aggiungere alcun PBS Incubare la sospensione tallone / anticorpo per 30 minuti a temperatura ambiente mediante l'agitatore vortex o rotatori tubo Lavare 3 volte con PBST come nel punto 3. Blocco con perline biotinilato BSA Dopo il terzo lavaggio aggiungere 10 mg / mg biotinilato BSA, regolare il volume a 300 ml con PBS, se necessario, e incubare con agitazione per 30 minuti Lavare 3 volte con PBST come nel punto 3 Risospendere le sfere in 100 ml di PBS/0.05% BSA. Azoturo di sodio possono essere aggiunti per la conservazione a lungo termine Utilizzando protocolli standard di NHS fluorescina, fluoresceinate l'anticorpo rivelatore Determinare il grado di Fluorescination 2. HCP – Sviluppo Preparare le soluzioni di lavoro: Anticorpo marcato con fluoresceina (Fl-Ab): La maggior parte CHO-HCP saggi uso Fl-Ab ad una concentrazione finale di 400 ng / ml. Il Fl-Ab è aggiunto come ¼ del volume saggio finale, quindi la concentrazione della soluzione di lavoro è di 1,6 mg / ml. Preparare questa soluzione diluendo magazzino Flab con BioScale Bead / flab diluente. Perle: la maggior parte CHO-HCP saggi uso perline ad una concentrazione finale di 2×10 5 pedine / ml. Il reagente tallone costituisce ¼ del volume saggio finale, quindi la concentrazione della soluzione di lavoro è 8×10 5 pedine / ml. Preparare questa soluzione diluendo magazzino tallone con BioScale Bead / flab diluente. Vortex lo stock tallone bene per assicurarsi che tutte le perle sono in sospensione prima di rimuovere una frazione. Esecuzione di buffer: La composizione del tampone di corsa può essere ottimizzata per gli anticorpi utilizzati per sviluppare il test, tuttavia diversi CHO-HCP test sono stati sviluppati utilizzando 10 mM tampone HEPES, 1% di Tween, pH 7.5. BioScale ha sviluppato un additivo per il tampone di corsa (in dotazione con il kit di sviluppo) che si aggiunge al buffer ad una concentrazione di 1% prima dell'uso. Diluire calibratori e campioni con diluente campione BioScale. 3. ViBE di configurazione del sistema Girare la workstation ViBE su Collegare l'alimentazione del sistema e dei rifiuti Il primo sistema Inserire una cartuccia ViBE Far passare il tubo Preparare modello di analisi compilando il foglio denominato "Setup campione". BioScale offre la possibilità di avere un modello di analisi per ogni dosaggio Workstation ViBE. Questo permette all'utente di modificare e salvare note specifiche nella scheda "Note" del modello di saggi diversi tenere un registro completo dell'esperimento. Modello di analisi configurazione iniziale: Inizia compilando il tavolo (angolo in alto a sinistra) del range di concentrazione degli standard nel saggio in "Setup campione" foglio. Successivamente, inserire ulteriori informazioni nella tabella a destra degli standard (impostazione della colonna semplici Per saperne, One Aggiungi reagenti e due configurazioni reagente Aggiungi) per indicare la workstation ViBE come campioni lunghi bisogno di incubare, come è il volume di reagente deve essere trasferita , per quanto tempo l'accumulo campione deve essere, e se condizionamento del sensore e la decontaminazione di sonde e cartucce sono necessari, ecc Compila il layout del pannello. Carico del campione / i reagenti in piastre. Il ViBE fornirà i volumi necessari per la piastra reagente. Volume del campione può variare, ma a metà di un volume dosaggio totale di 120 microlitri è un buon punto di partenza. Applicare copertine piatto. Caricare le piastre sul ponte workstation. Eseguire il test di avvio procedura guidata, passare attraverso procedura guidata e avviare test. 4. Rappresentante Risultati Figura 1: immunodosaggio a sandwich AMMP </p> Su una workstation ViBE, un saggio AMMP misura la concentrazione di antigene. Il segnale è misurato quando il tallone-antigene-anticorpo aptene si lega al sensore tramite l'aptene / anti-aptene interazione. Rigenerazione porta il sensore torna allo stato all'inizio rimuovendo il immunocomplessi. Figura 2: CHO-HCP curva di calibrazione Assay AMMP Figura 2 è un esempio di una curva di calibrazione CHO HCP saggio AMMP. Analisi può essere effettuata in campioni provenienti da tutto il flusso di purificazione compreso il reattore con alta precisione e riproducibilità. Figura 3: Proteina A AMMP curva di calibrazione di analisi Figura 3 è una curva di calibrazione per una proteina residua un test AMMP, eseguita con una proteina VIBE residua un kit di analisi. Lo stesso kit può essere utilizzato per un test veloce con un periodo di incubazione di 30 minuti, o per risultati più sensibili e più ampia gamma dinamica, con un periodo di incubazione più lungo, senza perdita di precisione o accuratezza, entrambi i quali sono in genere migliori di equivalente ELISA nel utenti ' mani Figura 4: Prodotto titolo AMMP Assay La stazione di lavoro ViBE può essere utilizzato anche per un saggio titolo del prodotto, i risultati mostrati in figura 4. Eseguita in modo diverso rispetto saggi AMMP, questo test non richiede trattamento del campione diverso da semplice diluizione o perline, e quantificazione è stata verificata in "no rotazione" campioni contenenti oltre 10 milioni di cellule in un ampio intervallo di Viabilità. Figura 5: Curva Assay AMMP standard per la GST-Gadd34 biomarker test Mostrata in Figura 5 è una curva standard di segnale ottenuto dal Bioanalyzer ViBE (Pannello A) o utilizzando la tecnologia AlphaScreen ricombinante GST-Gadd34. Risultati su piattaforma ViBE sono stati circa un registro più sensibili utilizzando gli stessi anticorpi. AMMP sfrutta la misura di un minor numero di particelle più grandi ma ancora beneficia soluzione di acquisizione e complessa fase di formazione di rilevamento. Figura 6: Curva Assay AMMP standard per la GST-Gadd34 a campione del tumore Nella Figura 6, l'induzione di Gadd34 da CWR22 xenotrapianti è stato testato in presenza o in assenza di un inibitore del proteasoma boronate come analizzato sia dal ViBE Bioanalyzer (Pannello A) o AlphaScreen (Pannello B). La piattaforma ViBE è stato in grado di produrre sensibili, risultati riproducibili in xenotrapianti tumorali in vivo, mentre il segnale è stato spento con AlphaScreen mcg maggiore di proteine. Questo esempio mostra la potenza della tecnologia AMMP in campioni molto complessi. Grazie al chip di rilevamento sensibili e ad alta efficienza del magnete vicino al chip, basso numero di microparticelle magnetiche possono pulire in modo efficace e riproducibile per target bassa abbondanza tra la complessità del lisato cellulare (compresi i reagenti lisi) e detriti sangue.