تحديد آثار الطفرات BRCA1 على التوحد باستخدام خلايا متماثلة التي تعبر عن الذاتية وحشية من نوع BRCA1
Summary
نحن نقدم طريقة لاختبار المتغيرات BRCA1 في نسيج ثقافة تستند مقايسة لإصلاح تأشب مثلي الحمض النووي من التلف من خلال استنفاد الذاتية البروتين BRCA1 من خلية باستخدام رني واستبدالها متحولة نقطة BRCA1 الذي يحتوي على تغيير الترميز.
Abstract
يمكن أن يكون معقدا في التحليل الوظيفي من الطفرات مغلطة من وجودها في الخلية من البروتين الذاتية. وتعقدت البنية الدالة تحليلات لBRCA1 من عدم وجود تجربة قوية للبروتين الكامل وطول BRCA1 الصعوبات الكامنة في العمل مع خطوط الخلايا التي تعبر عن البروتين hypomorphic BRCA1 1،2،3،4،5. وضعنا نظاما كان المنضب حاد البروتين BRCA1 الذاتية في خلية بواسطة رني استهداف 3' – UTR من BRCA1 مرنا وحلت محلها التعاون transfecting البلازميد معربا عن متغير BRCA1. ميزة واحدة من هذا الإجراء هو أن إسكات الحادة والمتزامنة استبدال BRCA1 تسمح للخلايا أن تنمو من دون طفرات الثانوية أو التعديلات التي قد تنشأ مع مرور الوقت للتعويض عن فقدان وظيفة BRCA1. وقد تم هذا النزف الداخلي وإضافة الى الوراء في خط الخلايا المشتقة من هيلا أن يعاير بسهولة لنشاط إعادة التركيب مثلي. يستند مقايسة تأشب مثلي على طريقة نشرها مسبقا حيث يتم إعادة التركيب المتكامل ركيزة في جينوم (الشكل 1) 6،7،8،9. هذه الركيزة إعادة التركيب يحتوي على انزيم القطع النادرة تقييد I – SCEI موقع داخل أليل GFP نشط ، والمصب الثاني أليل GFP نشط. ترنسفكأيشن من البلازميد التي تعبر عن I – SCEI النتائج في كسر مزدوج الجديلة ، والتي يمكن اصلاحها من خلال إعادة التركيب مثلي ، وإذا كان مثلي لا تأشب إصلاح كسر يخلق أليل GFP النشط الذي سجل بسهولة التدفق الخلوي للتعبير البروتين GFP . أدى استنزاف BRCA1 المحلية في الحد من 8-10 أضعاف في نشاط إعادة التركيب مثلي ، وإضافة الى الوراء البرية من نوع البلازميد الدالة تأشب استعادة كامل مثلي. عندما أعرب عن المسوخ نقطة محددة من BRCA1 طول الكامل من شارك في transfected البلازميدات ، يمكن سجل تأثير متحولة مغلطة محددة. كمثال على ذلك ، أعرب عن التعبير عن بروتين (M18T) BRCA1 ، وهو البديل من الأهمية السريرية غير معروفة 10 ، في هذه الخلايا ، إلا أنها أخفقت في استعادة BRCA1 التي تعتمد على إعادة التركيب مثلي. بواسطة التعبير ، وعلى النقيض من متغير آخر ، وهو أيضا من أهمية مجهولة ، BRCA1 (I21V) استعادة تامة BRCA1 التي تعتمد على وظيفة إعادة التركيب مثلي. وقد تم تطبيق هذه الاستراتيجية لاختبار وظيفة الطفرات BRCA1 مغلطة إلى نظام آخر للمعايرة وظيفة بيولوجية الجسيم المركزي (قيس وآخرون ، والملاحظات غير منشورة). عموما ، فإن هذا النهج هو مناسبة لتحليل المسوخ مغلطة في أي الجينات التي يجب تحليلها مقهور.
Protocol
Discussion
ميزة هذه الطريقة هو أن نتمكن من دراسة وظيفة البروتين BRCA1 في تنظيم إصلاح الحمض النووي من قبل إعادة التركيب مثلي باستخدام الخلايا التي تحتوي على التطور الطبيعي من النوع البري BRCA1 التي أعرب عنها. اعتمدنا منفصلين الوسائل المتبعة في دراسة عملية إعادة التركيب مثلي والاستفادة من رني بوساطة استنزاف للحصول على طريقة جديدة لاختبار المتغيرات BRCA1 لوظيفة في إصلاح الحمض النووي. وكان المفتاح لنجاح هذا الأسلوب لإنشاء خط خلية transfectable بسهولة ، مثل هيلا ، مع الركيزة إعادة التركيب في الجينوم بحيث نحصل على مستويات عالية جدا من تحويل GFP. كان لدينا فحص الحيوانات المستنسخة متعددة من التحول الأصلي من أجل الحصول على احد ان لم يكن GFP خلفية اكتشاف الإشارات ، ولكن عند ترنسفكأيشن للتعبير I – SCEI البلازميد كان على مستوى عال جدا من تحويل GFP.
مع هذا الأسلوب ، نحن نحقق الآن محددة أخرى BRCA1 مخلفات الأحماض الأمينية وظيفة في إعادة التركيب مثلي. جنبا إلى جنب مع رؤى البيولوجية من هذا العمل ، يمكن تطبيق هذه النتائج إلى علم الوراثة السرطان السريرية. وهناك نسبة عالية من الطفرات BRCA1 مغلطة لها أهمية سريرية غير معروف لأن هناك متغيرات كثيرة ونادرة لا توجد معلومات كافية عن العديد من هذه الجمعيات لتحديد سرطان بواسطة التحليل الجيني 3،10،13،14 العزل. باستخدام هذا الأسلوب ، يمكن أن تستخدم نتائج متغير معين على الوظيفة البيولوجية في تنظيم BRCA1 من إعادة التركيب مماثل لإعلام النساء الذين يحملون واحدة من هذه المتغيرات في الجينوم الخاصة بهم.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن ممتنون لمركز جامعة ولاية أوهايو الشامل للسرطان لتوفير التمويل اللازم لهذا العمل.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| DMEM | Invitrogen | 11960 | ||
| FBS | USA Scientific | 9871-5200 | ||
| siRNA | Invitrogen | N/A | ||
| Lipofectamine-2000 | Invitrogen | 11668 | ||
| TrypLE | Invitrogen | 12604 | ||
| Puromycin | Enzo Life Sciences | BML-GR312 | ||
| Opti-MEM I | Invitrogen | 31985 | ||
| Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360 | ||
| GlutaMAX I | Invitrogen | 35050 | ||
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140 |
References
- Carvalho, M. A. Determination of cancer risk associated with germ line BRCA1 missense variants by functional analysis. Cancer Res. 67, 1494-1501 (2007).
- Couch, F. J. Genetic epidemiology of BRCA1. Cancer Biol Ther. 3, 509-514 (2004).
- Couch, F. J. Assessment of functional effects of unclassified genetic variants. Hum Mutat. 29, 1314-1326 (2008).
- Tomlinson, G. E. Characterization of a breast cancer cell line derived from a germ-line BRCA1 mutation carrier. Cancer Res. 58, 3237-3242 (1998).
- Ruffner, H., Joazeiro, C. A., Hemmati, D., Hunter, T., Verma, I. M. Cancer-predisposing mutations within the RING domain of BRCA1: loss of ubiquitin protein ligase activity and protection from radiation hypersensitivity. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 5134-5139 (2001).
- Moynahan, M. E., Chiu, J. W., Koller, B. H., Jasin, M. Brca1 controls homology-directed DNA repair. Mol Cell. 4, 511-518 (1999).
- Nakanishi, K. Human Fanconi anemia monoubiquitination pathway promotes homologous DNA repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1110-1115 (2005).
- Pierce, A. J. Double-strand breaks and tumorigenesis. Trends Cell Biol. 11, 52-59 (2001).
- Ransburgh, D. J., Chiba, N., Ishioka, C., Toland, A. E., Parvin, J. D. Identification of breast tumor mutations in BRCA1 that abolish its function in homologous DNA recombination. Cancer Res. 70, 988-995 (2010).
- Easton, D. F. A systematic genetic assessment of 1,433 sequence variants of unknown clinical significance in the BRCA1 and BRCA2 breast cancer-predisposition genes. Am J Hum Genet. 81, 873-883 (2007).
- Snouwaert, J. N. BRCA1 deficient embryonic stem cells display a decreased homologous recombination frequency and an increased frequency of non-homologous recombination that is corrected by expression of a brca1 transgene. Oncogene. 18, 7900-7907 (1999).
- Pierce, A. J., Hu, P., Han, M., Ellis, N., Jasin, M. Ku DNA end-binding protein modulates homologous repair of double-strand breaks in mammalian cells. Genes Dev. 15, 3237-3242 (2001).
- Spearman, A. D. Clinically applicable models to characterize BRCA1 and BRCA2 variants of uncertain significance. J Clin Oncol. 26, 5393-5400 (2008).
- Sweet, K., Senter, L., Pilarski, R., Wei, L., Toland, A. E. Characterization of BRCA1 ring finger variants of uncertain significance. Breast Cancer Res Treat. 119, 737-743 (2009).
