使用内源性野生型BRCA1基因的细胞表达，确定同源重组的BRCA1基因突变的影响

1。综合复合基板的细胞系 PDR – GFP（质粒7 M. Jasin，纪念斯隆-凯特琳癌症中心的礼物）的HeLa细胞稳定转化，在转化的选择嘌呤维持。 细胞传代的DMEM / FB的，含10％小牛血清，GlutaMAX 2毫米，1毫米丙酮酸钠，青霉素/链霉素（100 U / mL/0.1毫克/毫升），和1.5微克/毫升的嘌呤。 在PDR – GFP质粒，并在稳定转化的重组基板，包含两个等位基因GFP（图1）处于非活动状态。一个等位基因是无效的，由于其编码序列的18 bp的限制性内切酶识别位点我SCEI列入。在这些细胞中的表达我的SCEI创建一个双链DNA断裂（DSB）。有这种DNA无效的GFP的第二个等位基因，但我SCEI网站上的第一个等位基因相关的部分，其序列与野生型。这第二次绿色荧光蛋白基因可作为一个序列同源重组修复的DSB捐助，将在一个活跃的绿色荧光蛋白基因，这是很容易，流式细胞仪检测结果。另外，DSB通过非同源末端连接，这将破坏我SCEI限制网站，并会导致GFP阴性细胞可以修复。在细胞同源重组的高低是由计数GFP阳性细胞的百分比。 pHeLa – DR13 – 9，该细胞系，被选为各克隆零背景GFP信号和GFP阳性细胞表达质粒，pCBASce后转与I – SCEI的比例相对较高。 （pCBASce和它的矢量控制，pCAGGS，同时提供由M. Jasin的纪念斯隆 – 凯特琳癌症中心。） 应要求作者提供的HeLa – DR13 – 9细胞株。 2。转染消耗内源性BRCA1基因突变的BRCA1加回。 第一染（通常是一个星期二）前一天：开始的HeLa – DR13 – 9细胞至少有90％的融合与一个10厘米的菜。 Trypsinize 1 mL和停止反应，加入9毫升的DMEM / FB的吹打混合以及。 添加40μL胰酶消化细胞，每孔0.5毫升/ FB的二甲醚在24孔板。 第1天转染（星期三）：细胞应约40-50％的汇合，如果要少得多重新来过。混合转染：5 pmol的siRNA + 0.3微克BRCA1基因突变表达质粒12.5μLOPTI – MEM DNA和0.5μL脂质体2000年以12.5μLOPTI – MEM。根据脂质体协议（Invitrogen公司）进行转染。 媒体4-6小时后更换。我们使用消耗BRCA1基因的siRNA是基于指定BRCA1基因3' – UTR序列的80780到80798（登录号AY273801）序列GCUCCUCUCACUCUUCAGU。 第2天：从24孔板trypsinizing到6孔板细胞转移。 第3天转染：25 pmol的siRNA + 0.75微克BRCA1基因突变表达质粒DNA + 0.75微克pCBASce 62.5μLOPTI – MEM和2.5μL脂质体2000年62.5μLOPTI – MEM（或pCAGGS矢量控制）。媒体4-6小时后更换。 3。分析转染。 第6天，trypsinize每口井的细胞，并停止在1毫升的DMEM / FB的。分析GFP表达的细胞可以在5或7天，但我们发现，每天6效果最好。 流式细胞仪分析10000个细胞。我们使用一个碧迪FACSCalibur仪器，在美国俄亥俄州立大学综合癌症中心的分析流式细胞仪共享资源。单，活细胞的门使用的前部和侧散射参数。使用GFP荧光检测器（FL1）检测到GFP阳性细胞，结果作为一个直方图（图2，底部）。 replated留在以上细胞可以通过荧光显微镜摄影，如果需要的话。 4。代表性的成果： BRCA1基因调节的途径，通过同源重组 6,11双双链DNA断裂修复。那些已经发生同源重组修复细胞很容易检测到荧光显微镜（图2，顶部）。减少在检测到GFP阳性细胞（图2右）在BRCA1基因的结果枯竭。从FACSCalibur的输出是在X轴和Y轴（图2，底部）的细胞数，每单元的强度与GFP的直方图。在一个典型的设置从单一的实验结果，15.5％的细胞GFP阳性后，我SCEI表达和控制RNAi的枯竭（图3）。相比之下，BRCA1和矢量枯竭加回减少GFP转换至0.7％。反加野生型BRCA1或完全恢复的BRCA1基因（I21V）同源重组，获得15-16％GFP阳性细胞的检测。反加的BRCA1供应量（M18T）突变体（图3，泳道5）矢量控制添加回类似的效果。由于这种变异9作为内源性蛋白表达水平相似，因此，我们解释的BRCA1（M18T）变种非同源重组功能。 我们通常有10-20％的细胞转换我SCEI表达质粒转染后GFP阳性。重复性的BRCA1基因的消耗减少约8-10倍的GFP阳性细胞的转化。虽然GFP阳性细胞的实际比例可能会改变在一项实验中，相对于控制枯竭的BRCA1基因枯竭实验，实验中，GFP阳性细胞的比例是相当一致的。我们通过设置不羁的转换率100％，与BRCA1基因枯竭和百分比的附加回的表达结果正常化的结果。这样，我们可以结合多个实验，实验的变化是不高的。 添加BRCA1基因的突变体，迄今已取得了强劲的结果：每个BRCA1基因变种完全恢复同源重组活动，或有没有效果。在取得这些成果的一个重要的考虑是，我们的转染条件BRCA1蛋白的生产水平，约等于在未经处理的细胞内源性蛋白的浓度。太多的甚至是BRCA1基因的突变体的过度表达可能导致了一些积极的同源重组活动。 我们需要克服的一个问题是转染的毒性。 BRCA1基因本身的消耗，可以减缓细胞的生长，脂质体2000年和质粒DNA盘上的细胞数量相对的平衡，必须在一致的水平。过多的脂质体或质粒DNA会减少细胞的数量，以及细胞的数量将不足以获得可靠的流式细胞仪检测结果。与转染细胞的数量的质粒和脂质体转染试剂的平衡是很重要的，对维持细胞的可行性。 图1。重组基板。 M. Jasin 7,12组已制定的策略是描绘。 PDR – GFP质粒包含两个绿色荧光蛋白基因有缺陷的等位基因，其中包含一个I – SCEI限制性内切酶位点。一个HeLa细胞源性细胞株包含此集成在基因组中的9的单个站点中的DNA底物，并积极修复的同源重组中的一个等位基因的转换GFP阳性的结果在我的SCEI网站的双链DNA打破。 图2荧光显微镜检测GFP阳性细胞。细胞按照此协议，测​​试和控制亏损的细胞活跃在同源重组中，由高比例的细胞与绿色荧光蛋白表达（左）检测。耗尽的BRCA1基因的GFP阳性细胞（右）的数量在急剧下降的RNAi结果。 图3。BRCA1基因的错义突变体的添加回结果。从单一的实验结果显示在此柱状图。在没有表达质粒转我的SCEI（巷1）有没有检测GFP阳性细胞。泳道2-6的结果都是从我SCEI表达质粒转染第3天的细胞。在细胞被耗尽无关（荧光素酶）基因和载体添加回，15.5％的细胞GFP阳性（2巷）。 BRCA1和矢量的消耗反加揭示损失的BRCA1基因同源重组的效果（泳道3）。 BRCA1和枯竭（4车道）的野生型BRCA1基因，BRCA1基因（M18T）（5巷）和BRCA1（I21V）（6车道）加回的影响。这些结果是从单一的实验中，将与至少两个以上的重复实验，以获得支持一个给定的突变BRCA1蛋白的同源重组的措施相结合。