Zymography의 기능 매트릭스 Metalloproteinases의 감지
Summary
이 프로토콜은 문화 supernatants이나 체액의 매트릭스 metalloproteinases 검출을위한 활동 기반의 분석을 설명합니다.
Abstract
매트릭스 metalloproteinases (MMPs)는 아연 함유 endopeptidases 있습니다. 그들은 펩티드 채권 절단하여 단백질을 저하. 더보기보다 20 MMPs가 확인된과 구조와 기판 특이성 (collagenases, gelatinases, 멤브레인 타입 [MT – MMP] stromelysins, matrilysins, 등)에 따라 여섯 그룹으로 구분됩니다. MMPs는 세포 침공, 연골 저하, 조직 리모델링, 상처 치유, 그리고 embryogenesis에 중요한 역할을한다. 그들은 따라서 두 정상 프로세스 및 류마티스 관절염, 암, 또는 만성 폐쇄 폐 질환 1-6 많은 질병의 pathogenesis에 참여합니다. 여기서는 MMP – 2 (gelatinase A, 유형 IV collagenase), MMP 널리 표현에 초점을 맞출 것이다. 우리는 zymography 먼저 C. Heussen 및 EB 다우 70-10에 의해 1980 년에 설명 일반적으로 사용되는 매우 민감한 아직 단순하고, 기술에 의해 세포 배양 supernatants에서 MMP – 2를 검출하는 방법을 보여줍니다 것입니다. 이 기술 세미 양적이며, 그것은 따라서 재조합 MMP 알려진 농도가 같은 겔 11 로드할 때 테스트 샘플에서 MMP 수준을 결정하는 데 사용할 수 있습니다.
그리고 젤라틴 (MMP – 2 기판), MMPs (예 : 세포 배양 supernatants, 소변, 또는 혈청)이있는 솔루션은 나트륨 dodecyl 황산염 (단백질 linearize하는 SDS)를 포함하는 polyacrylamide 젤에로드됩니다. 샘플 버퍼 (겔 로딩을 촉진하기) 샘플 점도를 높이기 위해 만들어진 것입니다, 추적 염료 (bromophenol 파란색, 샘플 마이 그 레이션을 모니터)를 제공 denaturing 분자를 (단백질 linearize)을 제공하고, 샘플의 산도를 제어합니다. 단백질은 다음 일정 마이 그 레이션 속도를 제공하기위한 실행 버퍼의 전류에 따라 마이 그 레이션하는 것이 허용됩니다. 이주의 거리는 반대로 단백질의 분자량 (작은 단백질이 큰 단백질은보다 젤을 통해 신속하게 이동하고 따라서 젤 아래 추가로 마이 그 레이션)와 상관 있습니다. 마이 그 레이션 후, 젤은 단백질이 효소 활동에 필요한 자신의 차 구조를, 다시 수 있도록 renaturing 버퍼에 배치됩니다. 젤은 다음 프로 테아제는 기판을 소화 수 있도록 설계된 개발 버퍼에 배치됩니다. 개발 버퍼는 또한 활성화된 MMPs에 비 proteolytic 프로 MMPs를 활성화하기 위해 P – aminophenylmercuric 아세테이트 (APMA)가 포함되어 있습니다. 다음 단계는 기판 (우리의 예제에서는 젤라틴) 염색법으로 구성되어 있습니다. 겔에서 여분의 염료를 세척 후, 테아제 소화 영역은 분명 밴드로 나타납니다. 명확하게 밴드가 더 집중 프로 테아제는가 포함되어 있습니다. 밴드 얼룩 강도는 다음 샘플 비교 있도록 같은 ImageJ 같은 소프트웨어를 사용, densitometry에 의해 결정하실 수 있습니다.
Protocol
Discussion
우리는 세포 배양 supernatants에서 MMP – 2의 zymographic 분석을 수행하는 방법을 증명하고있다.
젤에 로드할 샘플의 양은 경험적으로 관심의 기원과 MMP에 따라 결정되어야합니다. 단백 분해 효소가 밴드의 영역에서 소화 수있는 너무 많은 기판이 그대로 너무 로딩하는 동안 거의 감지하지 않도록 할 수도로드하면 채도가 발생할 수 있습니다. 필요한 경우, 샘플은 이전에 읽어 버퍼 또는 개발 시간과 믹싱에 탈이온수에 희석 수있는 데 4 시간이 하루에서 단축하실 수 있습니다. 그것은 concentrators (예 : Millipore 카탈로그 # UFC803024)를 사용하여 솔루션에 단백질을 집중하는 것도 가능합니다. 밴드가 겨우 보이는 남아있다면, 그것도 최대 48 시간, 시간의 긴 기간 동안 젤을 개발해야 할 수도 있습니다. 조직 문화 supernatants에서 샘플을 비교할 때, 그것은 태아 소 혈청 (및 기타 세라)가 결과에 영향을 미칠 수 MMPs를 포함 것을인지해야합니다. 이러한 이유로, 우리는 혈청이없는 배지에서 문화 이후 우리 supernatants 모두 수집합니다.
프로토콜의 단락 2.9 및 2.10에 명시된 세척은 소화 밴드의 얼룩 배경을 제거하기 위해 필요합니다. 더 이상 세척 시간은 젤 내내 기판의 얼룩 더 많은 배경을 제거 하겠지만도 희미합니다. 이상 세척 시간이 필요하는 경우, 우리는 최고의 명암으로 스캔을 선택 젤 매일 몇 시간을 스캔하는 것이 좋습니다.
이 기술은 다른 MMPs를 감지하는 데 사용할 수 있습니다. 젤라틴들이 선호하는 기판이 아니므로 예를 들어, MMP – 9는 낮은 정도 MMP – 1, MMP – 8과 MMP – 13 또한 젤라틴 젤에 대한 감지, 그리고 수 있습니다. 카제인은 MMP – 11에 대한 선호하는 기판이며, 또한 MMP – 1의 탐지, MMP – 3, MMP – 7, MMP – 12 및 MMP – 13을 허용하면서 MMP – 1과 MMP – 13은 최고의 콜라겐 zymography에 감지 9. MMP – 7 (matrilysin)와 collagenases (MMP – 1과 MMP – 13) 때 카제인이나 젤라틴 젤 낮은 수준에서 현재 감지하기가 어렵습니다. 겔 로딩 시간에 샘플로 헤파린의 또한 MMP – 7에 대한 검색 제한을 대폭 향상시킵니다. MMP – 1과 MMP – 13의 경우, 헤파린은 전기 실행이 방법은 12 세 미만 이미 후 겔에 추가되어야합니다.
zymography이 효소의 변성 및 renaturation 후 효소 활동을 측정 때문에, 그것은 샘플에있는 모든 MMPs의 활동을 측정합니다. 이것은 효소, 프로 효소, 그리고 내생 억제제 (예 : 팀프 – 2)에 바운드 효소를 포함합니다. 그것은 활성 효소의 밴드 밀도를 비교하여하고 약간 높은 분자량을 가지고되는, 프로 효소의의 예제에서 MMP 활성화 수준을 결정하는 그러나이 가능합니다.
Zymography은 종종 MMP을 확인하기에 충분하지 않습니다. 알려진 분자량 표준 MMP의 마이 그 레이션 수준의 비교는 식별에 도움이 되나요하지만 이러한 표준의 일부가 감소 요원을 포함하고 비 절감 조건에서 사용할 때 그들이 9 가지 분자 무게를 나타낼 수 있다고 언급한다. 옵션은 테스트 샘플과 같은 겔에 가용성 재조합 MMP를 로드할 수 있습니다. MMPs는 그러나 겉보기 분자량의 변화를 유도, 다른 단백질에 연결되어있을 수 있습니다. 선택적 MMP 억제제는 interest.A 초 기술 (웨스턴 블롯, immunocytochemistry, 또는 엘리사)의 MMP가하는 것이 좋습니다 정체성에 약리 도구로 개발 버퍼에 부화 중에 젤 (또는 반 젤 컷의 일부)에 추가할 수 있습니다 관심 MMP의 식별에 도움이됩니다. 그것은 서양 Blots에 대한 검색 제한이 기술을 사용하면 잠재적으로 거짓 – 부정적인 결과로 이어지는, 자주 zymographic 젤보다 훨씬 낮은 것을 지적해야합니다.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 세포 배양 supernatants에서 MMPs의 농도를 증가 단백질 concentrators의 사용을 제안에 대한 박사 S. 레슬러를 (분자 및 세포 생물학의학과 의학의 베일러 대학) 감사드립니다.
이 프로젝트는 부인이 클리포드 엘더 화이트 그레이엄 둘러 싸인 연구 기금과 CB에 대한 NIH / NIAMS (AR059838)에서 보조금에 의해 지원되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 NIH의 공식 견해를 대변하지 않습니다.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Xcell SureLock Mini-Cell CE mark electrophoresis apparatus | Invitrogen | EI0001 | ||
| Power supply (model 302) | VWR | 93000-744 | ||
| Novex 10% gelatin zymogram gels, 1.0 mm, 12 wells | Invitrogen | EC61752BOX | ||
| Blue Juice gel loading buffer | Invitrogen | 10816015 | ||
| Gel loading tips | VWR | 53509-015 | ||
| Protein molecular weight standard | Invitrogen | LC5800 | ||
| Novex Tris-Glycine-SDS running buffer | Invitrogen | LC2675 | ||
| Novex zymogram renaturing buffer | Invitrogen | LC2670 | ||
| Novex zymogram developing buffer | Invitrogen | LC2671 | ||
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | ||
| Epson Perfection 4490 Photo Scanner | Amazon | n/a | ||
| ImageJ software | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | n/a | Authored by W. Rasband, NIH/NIMH |
References
- Luo, J. The role of matrix metalloproteinases in the morphogenesis of the cerebellar cortex. Cerebellum. 4, 239-245 (2005).
- Pasternak, B., Aspenberg, P. Metalloproteinases and their inhibitors – diagnostic and therapeutic opportunities in orthopedics. Acta Orthop. 80, 693-703 (2009).
- Kessenbrock, K., Plaks, V., Werb, Z. Matrix metalloproteinases: regulators of the tumor microenvironment. Cell. 141, 52-67 (2010).
- Lagente, V., Boichot, E. Role of matrix metallopreoteinases in the inflammatory process of respiratory diseases. J. Mol. Cell. Cardiol. 48, 440-444 (2010).
- Rodríguez, D., Morrison, C. J., Overall, C. M. Matrix metallopreoteinases: what do they not do? New substrates and biological roles identified by murine models and proteomics. Biochim. Biophys. Acta. 1803, 39-54 (2010).
- Bourboulia, D., Stetler-Stevenson, W. G. Matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs): positive and negative regulators in tumor cell adhesion. Semin. Cancer Biol. , (2010).
- Heussen, C., Dowdle, E. B. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Analytical Biochem. , 102-196 (1980).
- Lombard, C., Saulnier, J., Wallach, J. Assays of matrix metalloproteinases (MMPs) activities: a review. Biochimie. 87, 265-272 (2005).
- Snoek-van Beurden, P. A., Von den Hoff, J. W. Zymographic techniques for the analysis of matrix metalloproteinases and their inhibitors. Biotechniques. 38, 73-83 (2005).
- Kupai, K., Szucs, G., Cseh, S., Hajdu, I., Csonka, C., Csont, T., Ferdinandy, P. Matrix metalloproteinase activity assays: importance of zymography. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 61, 205-209 (2010).
- Kleiner, D. E., Stetler-Stevenson, W. G. Quantitative zymography: detection of pictogram quantities of gelatinases. Anal. Biochem. 218, 325-329 (1994).
- Yu, W. H., Woessner, J. F. Heparin-enhanced zymographic detection of matrilysin and collagenases. Anal. Biochem. 293, 38-42 (2001).
