Rilevamento delle metalloproteinasi della matrice funzionale di zimografia

1. Caricamento ed esecuzione del Gel Tutti i campioni devono essere preparati in modo adeguato per mantenere la funzione degli enzimi e utilizzato immediatamente dopo la raccolta o conservati congelati a -80 ° C. I campioni non devono contenere agenti riducenti (un β-mercaptoetanolo) o essere bollito prima di caricare gel. Aprire il sacchetto contenente un gel all'interno di una cassetta, la cassetta di risciacquo con acqua deionizzata. Rimuovere il nastro protettivo dalla parte inferiore della cassetta e il pettine dalla parte superiore del gel. Lavare i pozzetti tre volte con tampone di corsa (diluito in acqua deionizzata 1X). Posizionare il gel nella Mini-Cell, assicurando che il lato minore della cassetta volti verso l'interno. Bloccare in posizione con il cuneo tensione Gel. Il Mini-Cell permette di eseguire uno o due gel in parallelo. Riempire la parte superiore (interno) da camera con 1X tampone di corsa sopra il livello del pozzi, verificare eventuali perdite. In caso di perdite, rimuovere il buffer e riposizionare il gel. Riempire la camera inferiore con 1X tampone di corsa. Carico 10 l di proteine ​​marker molecolari in un pozzetto. Mescolare una pari quantità di gel-caricamento del buffer e del campione e caricare nei pozzetti del gel con gel-loading punte (cambio tra un campione). Questi pozzi possono essere caricati fino a 20 microlitri totale. Mettere il coperchio sulla Mini-Cell e collegare i cavi degli elettrodi per l'alimentazione. Accendere l'alimentatore e impostare l'esecuzione a 125 V costante per 90 minuti. Controllare la formazione di piccole bolle sul filo della camera bassa, indicando circolazione di corrente. Quando si esegue il primo gel, monitorare i progressi della migrazione ogni 15 minuti, usando il blu di bromofenolo inclusi nel tampone di caricamento come indicatore. Lasciate che il gel fino a correre il colorante indicatore raggiunge il fondo del gel. 2. Rinaturazione e Sviluppo del Gel Per ogni gel, la preparazione di 100 ml di tampone 1X rinaturazione e 200 ml di denaturazione tampone, sia in acqua deionizzata. Quando il colorante blu bromofenolo inseguimento raggiunge il fondo del gel, passare l'alimentazione elettrica, aprire il Mini-Cell, e rimuovere il gel. Separare le due parti della cassetta con il coltello gel (o una spatola di pesatura). Tagliare un angolo per segnare la direzione del gel. Rimuovere accuratamente il gel dal cassetto e posto in un contenitore con 100 mL di tampone di rinaturazione. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente e scuotendo con cautela. Rimuovere il tampone rinaturazione e aggiungere 100 ml di sviluppo tampone al gel. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente e scuotendo con cautela. Rimuovere il tampone sviluppo e aggiungere 100 mL di tampone più via di sviluppo per il gel. Incubare per una notte (16-18 ore) a 37 ° C. Rimuovere il tampone sviluppo e lavare tre volte (5 minuti ciascuno) con acqua deionizzata sotto agitazione a temperatura ambiente. Scansione del gel per salvare l'esatto posizionamento di bande di serie della proteina come diventeranno meno o non visibile dopo colorazione gel. Macchiare il gel con l'aggiunta di 20 ml di SimplyBlue Safestain al gel. Incubare per 1 ora a temperatura ambiente sotto agitazione. Rimuovere il SafeStain SimplyBlue e de-macchia il gel in 100 ml d'acqua più o deionizzata per un'ora a temperatura ambiente sotto agitazione. Per ottenere risultati migliori, sostituire con fresca acqua deionizzata e incubare per un'altra ora o più a temperatura ambiente sotto agitazione. 3. Analisi dei dati Rimuovere accuratamente il gel dall'acqua e posto in un protettore foglio di plastica. La scansione del gel con una risoluzione di 300 dpi o superiore. Salvare l'immagine in formato TIFF (Figura 1A). Misura intensità band con ImageJ (o un altro software simile). Aprire il file TIFF in ImageJ (Figura 1A). Visualizza in bianco e nero, selezionando "Immagine>> Tipo 8-bit" (Figura 1B). Utilizzare lo strumento di selezione rettangolare a delineare la prima band, disegnando un rettangolo almeno due volte più alto che largo (questo è un requisito software). Premere il tasto "1" o selezionare "Analizza> Gel> corsia Seleziona prima" e la band sarà delineato. Un nuovo rettangolo apparirà, spostarlo nella fascia successiva e selezionare "Analizza> Gel> corsia Seleziona". Ripetere fino a quando tutte le bande sono selezionati (Figura 1B). Premere "3" oppure selezionare "Analizza> Gel> corsie Plot" per generare il grafico di profilo per ogni banda (Figura 1C). Utilizzare la selezione in linea retta (dovrebbe essere già selezionata automaticamente) per tracciare linee di base in modo che il picco di interesse è un'area completamente recintata. Selezionare lo strumento bacchetta magica e fare clic all'interno di ogni picco per selezionarlo. Selezionare "Analizza> Gel> picchi Label" per ottenere una tabella con l'area di ciascun picco selezionata. Questi dati possono essere rappresentati come tali (F1D IGURA) o può essere normalizzata al valore di un gruppo scelto. Questa normalizzazione è particolarmente importante quando i valori da mettere in comune diverse gel replicare per determinare la significatività statistica dei risultati. 4. Rappresentante Risultati Mostriamo un gel con 11 pozzi caricato con surnatanti diverse colture di cellule contenenti diverse quantità di MMP-2 (Figura 1A). L'osservazione diretta di questo gel mostra evidenti differenze nelle concentrazioni di MMP-2 tra alcuni dei pozzetti. Per esempio, è chiaro che i pozzi # 4 e 5 contengono molto di più MMP-2 che bene # 11 o anche ben # 10. Per la quantificazione oggettiva delle band che abbiamo usato densitometria con il software ImageJ (Figura 1B-D), confermando una differenza di circa 4 volte in MMP-2 importi tra bene # 11 e # pozzi 4 e 5 e una differenza di circa 2 volte a MMP-2 e gli importi compresi tra # 10 e # pozzi 4 e 5. Figura 1. Rilevazione di MMP-2 da zimografia gelatina. A, L'immagine acquisita di un gel gelatina. I numeri sono ben indicate nella parte superiore del gel. B, gel Stessa Un mostrato in bianco e nero per la densitometria. Ogni banda è stato selezionato con un rettangolo in ImageJ. C, due esempi di profili di densitometria per il gel mostrato in A e B (bande # 4 e # 11). Una linea retta è stato redatto alla base di ogni picco di creare uno spazio chiuso. D, Plot delle aree di picco per il gel mostrato in A e B (a destra) normalizzazione prima (a sinistra) e dopo alla densità di banda # 1. Figura 2. Questa figura dimostra come zimografia può essere usato come un semi-quantitativa tecnica. Abbiamo caricato diluizioni seriali (passi di 1:1 diluizioni) in 7 pozzi consecutivi e misurato la densità di banda sia per i pro-MMP-2 e MMP-2.