Erkennung von Functional Matrix-Metalloproteinasen durch Zymographie
Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine activity-based-Assay zum Nachweis Matrixmetalloproteinasen in Kulturüberständen oder Körperflüssigkeiten.
Abstract
Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) sind Zink-haltigen Endopeptidasen. Sie bauen Proteine durch Spaltung von Peptidbindungen. Mehr als zwanzig MMPs wurden identifiziert und sind in sechs Gruppen auf ihre Struktur und Substratspezifität (Kollagenasen, Gelatinasen Membran Typ [MT-MMP], Stromelysine, matrilysins, und andere) basieren getrennt. MMPs spielen eine entscheidende Rolle bei der zellulären Invasion Knorpelabbau, Gewebe-Remodeling, Wundheilung, und Embryogenese. Sie daher in normalen Prozessen und in der Pathogenese vieler Erkrankungen, wie rheumatoide Arthritis, Krebs oder chronisch-obstruktiver Lungenerkrankung 1-6 teilnehmen. Hier werden wir uns auf MMP-2 (Gelatinase A, Typ IV Kollagenase), eine weit verbreitete Ausdruck MMP konzentrieren. Wir werden zeigen, wie MMP-2 in Zellkulturüberständen erkennen zymographisch, eine häufig verwendete, einfache und doch sehr sensible Technik zuerst 1980 von C. Heussen und EB Dowdle 7-10 beschrieben. Diese Technik ist semi-quantitative, kann es daher zur MMP Ebenen in Testproben zu bestimmen, wenn bekannte Konzentrationen von rekombinanten MMP auf dem gleichen Gel 11 sind geladen werden.
Und Gelatine (Substrat für MMP-2); Lösungen, die MMPs (zB Zellkulturüberstände, Urin oder Serum) werden auf ein Polyacrylamidgel mit Natriumdodecylsulfat (um die Proteine zu linearisieren SDS) geladen. Der Probenpuffer wurde entwickelt, um Proben Viskositätsanstieg (bis Gelbeladung zu erleichtern), eine Tracking-Farbstoff (Bromphenolblau; zum Beispiel die Migration-Monitor), bieten denaturierenden Moleküle (Proteine linearisieren) und Kontrolle der pH-Wert der Probe. Proteine sind dann unter einen elektrischen Strom in einem Laufpuffer entworfen, um eine konstante Wanderungsgeschwindigkeit bieten zu migrieren. Der Abstand der Migration ist umgekehrt mit dem Molekulargewicht des Proteins (kleine Proteine schneller bewegen durch das Gel als große Proteine und damit die Migration weiter unten in der Gel) korreliert. Nach der Migration wird das Gel in einer Renaturierungspuffer gelegt, damit Proteine ihre Tertiärstruktur, die für enzymatische Aktivität wiederzugewinnen. Das Gel wird dann in einem Entwicklungsland Puffer so konzipiert, dass die Protease seine Substratverdau platziert. Die Entwicklung Puffer enthält auch p-aminophenylmercuric (APMA), um den nicht-proteolytische Pro-MMPs in den aktiven MMPs aktivieren. Der nächste Schritt besteht in der Färbung des Substrats (Gelatine in unserem Beispiel). Nach dem Waschen der überschüssigen Farbstoff aus dem Gel Bereichen Proteaseverdau als klare Streifen erscheinen. Je klarer die Band, je konzentrierter die Protease enthält. Band Färbeintensität kann dann durch Densitometrie ermittelt werden, mit einer Software wie ImageJ, so dass für die Probenvorbereitung Vergleich.
Protocol
Discussion
Wir haben gezeigt, wie man zymographische Analyse der MMP-2 in Zellkulturüberständen durchzuführen.
Die Höhe der Probe auf ein Gel Last muss empirisch ermittelt je nach Herkunft und MMP von Interesse sein. Lädt zu wenig wird Erkennung verhindern beim Laden zu viel kann bis zur Sättigung führen, da es nur so viel Substrat einer Protease im Bereich der Band verdauen können. Falls erforderlich, kann die Probe in deionisiertem Wasser vor dem Mischen mit Ladepuffer oder die Entwicklungszeit verdünnt werden kann de reduziert von über Nacht bis 4 Stunden. Es ist auch möglich, Proteine in einer Lösung mit Konzentratoren (zB Millipore Katalog # UFC803024) konzentrieren. Wenn Bands kaum sichtbar bleiben, kann es notwendig sein, um die Gele für einen längeren Zeitraum zu entwickeln, auch bis zu 48 Stunden. Bei der Vorbereitung Proben aus Zellkultur-Überstände, darauf hinzuweisen, dass fötales Rinderserum (und andere Seren) MMPs, dass die Ergebnisse beeinflussen können, enthält. Aus diesem Grund erheben wir alle unsere Überstände nach der Kultur in serum-freiem Medium.
Die Waschungen in den Absätzen 2.9 und 2.10 des Protokolls beschrieben sind notwendig, um die Hintergrundfärbung der verdauten Bands entfernen. Längere Waschzeiten löscht mehr Hintergrund, sondern auch dim die Färbung des Substrates durch das Gel. Wenn mehr Waschzeiten notwendig sind, empfehlen wir das Scannen des Gels alle paar Stunden, um den Scan mit dem besten Kontrast zu wählen.
Diese Technik kann verwendet werden, um andere MMPs zu erkennen. Zum Beispiel kann MMP-9 auf Gelatine-Gelen nachgewiesen werden, und auch in geringerem Umfang MMP-1, MMP-8 und MMP-13 wie Gelatine ist nicht ihr bevorzugtes Substrat. MMP-1 und MMP-13 sind am besten auf Kollagen Zymographie erkannt, während Kasein ist das bevorzugte Substrat für die MMP-11 und ermöglicht auch den Nachweis von MMP-1, MMP-3, MMP-7, MMP-12 und MMP-13 9. MMP-7 (Matrilysin) und Kollagenasen (MMP-1 und MMP-13) sind schwer zu erkennen, wenn in geringen Mengen in Kasein oder Gelatine-Gelen. Die Zugabe von Heparin auf die Probe zum Zeitpunkt der Gel-loading verbessert die Nachweisgrenze für MMP-7. Für MMP-1 und MMP-13, muss das Heparin zu dem Gel nach der elektrophoretischen Lauf ist bereits im Gange 12.
Da Zymographie Maßnahmen enzymatische Aktivität nach Denaturierung und Renaturierung der Enzyme, wird es messen die Aktivität aller MMPs in der Probe vorhanden. Dies sind Enzyme, Pro-Enzyme und Enzyme gebunden endogenen Inhibitoren (zB TIMP-2). Es ist jedoch möglich, das Niveau der MMP Aktivierung in der Probe durch den Vergleich der Band Dichte des aktiven Enzyms und dass der Pro-Enzym, das einen etwas höheren Molekulargewicht bestimmen.
Zymographie ist oft nicht ausreichend, um eine MMP zu identifizieren. Vergleich der Höhe der Migration eines MMP mit bekanntem Molekulargewicht-Standards ist bei der Identifizierung helfen, aber es sei darauf hingewiesen, dass einige dieser Standards ein Reduktionsmittel enthalten, und dass, wenn sie unter nicht-reduzierenden Bedingungen verwendet sie unterschiedliche Molekulargewichte 9 geben werden. Eine Option ist, um eine lösliche rekombinante MMP auf dem gleichen Gel als die Prüflinge zu laden. MMPs kann jedoch mit anderen Proteinen assoziiert sein, Induktion einer Änderung der scheinbaren Molekulargewicht. Selektive MMP-Inhibitoren kann das Gel (oder ein Teil eines Gels halbiert) während der Inkubation in der Entwicklung Puffer als pharmakologische Werkzeuge, um die Identität hinzugefügt werden die MMP von interest.A zweite Technik (Western Blot, Immunzytochemie, oder ELISA) zu empfehlen Hilfe bei der Identifizierung der MMP von Interesse. Anzumerken ist, dass Nachweisgrenzen für Western Blots oft viel niedriger als die der zymographische Gele, was möglicherweise zu falsch-negative Ergebnisse bei der Verwendung dieser Technik werden.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Herrn Dr. S. Ressler (Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine) für die Annahme, die Verwendung von Protein-Konzentratoren, um die Konzentration von MMPs in Zellkulturüberständen erhöhen danken.
Dieses Projekt wurde durch Zuschüsse der Mrs. Clifford Elder Weiß Graham Stiftungsprofessur Research Fund und die NIH / NIAMS (AR059838) zu CB unterstützt. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die offizielle Meinung des NIH.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Xcell SureLock Mini-Cell CE mark electrophoresis apparatus | Invitrogen | EI0001 | ||
| Power supply (model 302) | VWR | 93000-744 | ||
| Novex 10% gelatin zymogram gels, 1.0 mm, 12 wells | Invitrogen | EC61752BOX | ||
| Blue Juice gel loading buffer | Invitrogen | 10816015 | ||
| Gel loading tips | VWR | 53509-015 | ||
| Protein molecular weight standard | Invitrogen | LC5800 | ||
| Novex Tris-Glycine-SDS running buffer | Invitrogen | LC2675 | ||
| Novex zymogram renaturing buffer | Invitrogen | LC2670 | ||
| Novex zymogram developing buffer | Invitrogen | LC2671 | ||
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | ||
| Epson Perfection 4490 Photo Scanner | Amazon | n/a | ||
| ImageJ software | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | n/a | Authored by W. Rasband, NIH/NIMH |
References
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