Etiquetado de la F-actina Finaliza púas con Rodamina-actina en permeabilizadas Conos de Crecimiento Neuronal
Summary
Un método para visualizar y cuantificar la F-actina fines de púas en los conos de crecimiento neuronal se describe. Después de las neuronas de cultivo en cubreobjetos de vidrio, las células se permeabilized con una solución de saponina que contiene. A continuación, un corto de incubación con el tampón de saponina que contiene rodamina-actina incorpora actina fluorescente en los extremos de actina de púas libre.
Abstract
Las puntas móviles de los axones en crecimiento se llaman los conos de crecimiento. Los conos de crecimiento llevan navegando a través de los axones tejidos en desarrollo mediante la interacción con las señales a nivel local expresó su orientación molecular que se unen a los receptores de cono de crecimiento y regular la dinámica y la organización del citoesqueleto de crecimiento de 6.3 cono. El objetivo principal de estas señales de navegación es la malla de filamentos de actina que llena la periferia del cono de crecimiento y que el crecimiento de las unidades de la motilidad del cono a través de polimerización de la actina y la remodelación continua dinámica 7. Señales de orientación positiva o atractivo inducir cono de crecimiento de inflexión mediante la estimulación de filamentos de actina (F-actina) de polimerización en la región de la periferia del cono de crecimiento que está más cerca de la fuente de la señal atrayente. Esta polimerización de la actina unidades cono de crecimiento local saliente, la adhesión del margen de líderes y la elongación axonal hacia el atrayente.
Polimerización de la actina del filamento depende de la disponibilidad de monómero de actina suficiente y en los núcleos de polimerización de filamentos de actina o los extremos de púas para la adición de monómero. Actina monómero está disponible en abundancia en el ganglio de la raíz de pollo y la retina dorsal (GRD) los conos de crecimiento. En consecuencia, la polimerización se incrementa rápidamente cuando es libre F-actina fines de púas que se disponga para la adición de monómeros. Esto ocurre en el pollo y los conos de la retina DRG crecimiento a través de la activación local de la actina cortar la F-actina proteína de factor de despolimerización (ADF / cofilina) en la región del cono de crecimiento cercano a un 80-10 atrayente. Este incremento de la ADF / cofilina actividad rompe los filamentos de actina para crear nuevos F-actina fines de púas para la polimerización. El método siguiente se muestra este mecanismo. Contenido total de F-actina se visualizaron por tinción con phalloidin fluorescente. F-actina fines de púas son visualizados por la incorporación de la rodamina-actina dentro de los conos de crecimiento que se permeabilized con el procedimiento descrito en el siguiente, que es una adaptación de los estudios previos de otras células móviles 11, 12. Cuando rodamina-actina se añade a una concentración por encima de la concentración crítica para la adición de monómeros de actina a los fines de púas, rodamina-actina reúne a los extremos libres de púas. Si la señal atractiva se presenta en una pendiente, como la de ser liberado de una micropipeta colocada a un lado de un cono de crecimiento, la incorporación de la rodamina-actina en la F-actina fines de púas será mayor en el lado del cono de crecimiento hacia la micropipeta 10 .
Los conos de crecimiento son las estructuras celulares pequeños y delicados. Los procedimientos de permeabilización, rodamina-actina incorporación, la fijación y la visualización de fluorescencia son cuidadosamente hecho y puede llevarse a cabo en el escenario de un microscopio invertido. Estos métodos pueden ser aplicados al estudio de polimerización de la actina en las neuronas migratorias locales, otras células de los tejidos primarios o líneas celulares.
Protocol
Discussion
Los métodos presentados aquí permiten una resolución temporal y espacial de los componentes celulares que participan en la remodelación dinámica del citoesqueleto de actina en el borde principal de la migración de los conos de crecimiento. La acción de las moléculas de atrayente, como NGF o netrina, para estimular la rápida polimerización de la actina del filamento se revela como un aumento local en los extremos de actina de púas, creado por la ruptura de filamentos de actina por la activación de ADF / cofil…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen al Dr. James Bamburg y miembros de su laboratorio para la colaboración en estos estudios. Este trabajo fue financiado por subvenciones del NIH HD19950, EY07133 y por becas de la Fundación Médica de Minnesota.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 18×18 mm coverslip | Gold Seal | 3305 | ||
| 35mm Petri dishes | Falcon | 351008 | ||
| Aquarium cement | DAP 100% silicone aquarium sealant | Any hardware store | ||
| Poly-D-lysine (mw > 300,000) | Sigma | P1024 | ||
| Natural mouse laminin | Invitrogen | 23017-015 | ||
| L1 CAM | R & D systems | 777-NC | ||
| Alexa-fluor 350 phalloidin | Invitrogen (Molecular Probes) | A22281 | ||
| Rhodamine non-muscle actin | Cytoskeleton, Inc. | APHR-A | ||
| F12 Culture medium | Invitrogen (Gibco) | 21700-075 | ||
| B27 | Invitrogen (Gibco) | 17504-044 | ||
| Slowfade | Invitrogen | 536937 |
References
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