Transfectie en mutagenese van Target genen in cellen Mosquito door Locked Nucleic Acid-gemodificeerde oligonucleotiden
Summary
Oligonucleotiden kunnen worden gebruikt om de website speciaal een single nucleotide van getransfecteerde doelwitgenen vervanger in beide<em> Anopheles gambiae</em> En<em> Anopheles stephensi</em> Cellen.
Abstract
Plasmodium parasieten, de verwekker van malaria, worden overgedragen door de beten van geïnfecteerde Anopheles muggen wat resulteert in meer dan 250 miljoen nieuwe infecties per jaar. Ondanks tientallen jaren van onderzoek, is er nog steeds geen vaccin tegen malaria, met de nadruk op de noodzaak van nieuwe bestrijdingsstrategieën. Een innovatieve aanpak is het gebruik van genetisch gemodificeerde muggen zij daadwerkelijk toezicht kunnen malaria parasiet transmissie. Opzettelijke veranderingen van de cel signaalwegen in de mug, via gerichte mutagenese, is gebleken dat parasiet ontwikkeling 1 te reguleren. Uit deze studies, kunnen we beginnen om potentiële gen doelstellingen voor de transformatie te identificeren. Gerichte mutagenese is traditioneel gebaseerd op de homologe recombinatie tussen een target-gen en een groot DNA-molecuul. Echter, de bouw en het gebruik van dergelijke complexe DNA-moleculen voor het genereren van stabiel getransformeerde cellijnen is kostbaar, tijdrovend en vaak inefficiënt. Daarom is een strategie met behulp van gesloten nucleïnezuur-gemodificeerde oligonucleotiden (LNA-ons) biedt een bruikbaar alternatief voor de invoering van kunstmatige single nucleotide substituties in episomale en chromosomaal DNA-gen doelstellingen (beoordeeld in 2). LNA-ON-gemedieerde gerichte mutagenese is gebruikt om puntmutaties introduceren in interessante genen in gekweekte cellen van zowel de gist en muizen 3,4. We tonen hier dat LNA-ons kunnen worden gebruikt om een enkele nucleotide verandering in een getransfecteerde episomale doel dat resulteert in een switch van blauw fluorescerend eiwit (BFP) uitdrukking aan green fluorescent protein (GFP) tot uitdrukking in zowel de Anopheles gambiae en Anopheles stephensi cellen te introduceren . Deze conversie toont voor het eerst dat een effectieve mutagenese van target genen in mug cellen kan worden gemedieerd door LNA-ons en suggereert dat deze techniek van toepassing kunnen zijn op mutagenese van chromosomale doelen in vitro en in vivo.
Protocol
Discussion
Hier presenteren wij een in-vitro-methode en aanwijzingen voor gerichte omzetting van een enkele nucleotide in een episomaal gen doelwit na transfectie van LNA-ONS in A. stephensi en A. gambiae cellen. LNA-ON-gemedieerde genconversie vereist inductie van een site-specifieke DNA-herstel reactie; onze gegevens blijkt dat de mug cellen kunnen dit mechanisme voor site-specifieke mutagenese ondersteuning. Terwijl de hier gepresenteerde methode is gebaseerd op de omzetting van een episomaal doel, on…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen graag Abbie Spinner danken aan het California National Primate Research Center voor haar hulp bij flowcytometrie. Dit onderzoek werd ondersteund door de financiering van het Nationaal Instituut voor Allergie en Infectieziekten (NIAID) National Institutes of Health (NIH) AI073745, AI080799, en AI078183.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Effectene transfection reagent | Qiagen | 301425 | ||
| GFP control plasmid (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg) | Invitrogen | K4935-00 | ||
| BFP plasmid (pcDNA5/FRT/TO) | Gift from Dr. Concordet3 | |||
| LNA-ONs | Gift from Dr. Concordet3 | |||
| MEM, Earle’s w/ glutamine | Invitrogen | 11095 | ||
| Fetal calf serum (FCS) | Invitrogen | 16000 | ||
| Schneider’s Drosophila medium | Invitrogen | 11730 | ||
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140 | ||
| 10% D-glucose | Sigma | G5767 | ||
| Penicillin-streptomycin antibiotic | Invitrogen | 15140 | ||
| 6-well culture plates | Corning | 3516 |
References
- Corby-Harris, V. D. A., Watkins de Jong, L., Pakpour, N., Antonova, Y., Ziegler, R., Ramberg, F., Lewis, E. E., Brown, J. M., Luckhart, S. L., Riehle, M. A. A novel strategy for controlling malaria transmission in the mosquito Anopheles stephensi. PLOS Pathogens. , (2010).
- Braasch, D. A., Corey, D. R. Locked nucleic acid (LNA): fine-tuning the recognition of DNA and RNA. Chem Biol. 8, 1-7 (2001).
- Andrieu-Soler, C. Stable transmission of targeted gene modification using single-stranded oligonucleotides with flanking LNAs. Nucleic Acids Res. 33, 3733-3742 (2005).
- Parekh-Olmedo, H., Drury, M., Kmiec, E. B. Targeted nucleotide exchange in Saccharomyces cerevisiae directed by short oligonucleotides containing locked nucleic acids. Chem Biol. 9, 1073-1084 (2002).
- Rhee, W. J., Santangelo, P. J., Jo, H., Bao, G. Target accessibility and signal specificity in live-cell detection of BMP-4 mRNA using molecular beacons. Nucleic Acids Res. 36, e30-e30 (2008).
- Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. Genotyping SNPs with molecular beacons. Methods Mol Biol. 212, 111-128 (2003).
- Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. Multicolor molecular beacons for allele discrimination. Nat Biotechnol. 16, 49-53 (1998).
- Blandin, S. A. Dissecting the genetic basis of resistance to malaria parasites in Anopheles gambiae. Science. 326, 147-150 (2009).
- Niare, O. Genetic loci affecting resistance to human malaria parasites in a West African mosquito vector population. Science. 298, 213-216 (2002).
- Riehle, M. M. Natural malaria infection in Anopheles gambiae is regulated by a single genomic control region. Science. 312, 577-579 (2006).
