A 96 de microtitulación y placa basada en el método para la formación de Control y pruebas de sensibilidad antifúngica Candida albicans Las biopelículas
Summary
Se describe un método simple, rápido y robusto para la formación de<em> Candida albicans</em> Biofilms de 96 placas de microtitulación bien y su utilidad en las pruebas de sensibilidad antifúngica de las células dentro de los biofilms.
Abstract
Candida albicans es la causa más frecuente de las infecciones por hongos en una creciente población de pacientes inmunocomprometidos y la candidiasis es ahora la tercera enfermedad más común en los hospitales de los EE.UU.. Diferentes manifestaciones de la candidiasis se asocia con la formación de biofilm, tanto en los tejidos del huésped y / o dispositivos médicos (catéteres es decir). Formación de biopelículas lleva consecuencias negativas en la clínica, como las células dentro de los biofilms están protegidos de las respuestas inmunitarias del huésped y de la acción de los antifúngicos. Hemos desarrollado un modelo simple, rápido y robusto in vitro para la formación de C. biofilms albicans de 96 y placas microtiter, que también puede ser utilizado para las pruebas de bio-película de sensibilidad antifúngica. La lectura de este ensayo es colorimétrico, basado en la reducción de XTT (una sal de tetrazolio) por las células metabólicamente activas biopelículas fúngicas. Un experimento típico dura aproximadamente 24 horas para la formación de biofilm, con un adicional de 24 horas para las pruebas de sensibilidad antifúngica. Debido a su simplicidad y el uso de materiales de laboratorio comúnmente disponibles y el equipo, esta técnica democratiza la investigación del biofilm y representa un paso importante hacia la normalización de las pruebas de sensibilidad antifúngica de las biopelículas fúngicas.
Protocol
Discussion
A continuación se describe una forma simple, rápida, económica y altamente reproducible 96 modelo y placa de microtitulación para la formación de biopelículas de Candida, junto con un método colorimétrico que mide la actividad metabólica de las células dentro del biofilm con XTT. Este modelo 96 y placas de microtitulación para la formación de biofilm fue desarrollado originalmente para C. albicans, pero se puede utilizar para otras especies de Candida. y fácilmente adaptable a otr…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biopelícula relacionadas con el trabajo en el laboratorio es financiado por donaciones y numeradas R21DE017294 R21AI080930 del Instituto Nacional de Investigación Dental y Craneofacial y el Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas (a JLL-R.). El contenido es responsabilidad exclusiva de sus autores y no representan necesariamente la opinión oficial de la NIDCR, el NIAID oa los NIH.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Sabouraud-dextrose agar | Becton Dickinson | 211584 | To prepare plates for fresh subcultures of fungal isolates | |
| YPD: Yeast peptone dextrose | US Biological | Y2076 | Medium for propagation of overnight liquid cultures | |
| RPMI-1640 without sodium bicarbonate supplemented with L-glutamine | Cellgro | 50-020-PB | Liquid medium for biofilm formation | |
| Morpholinepropanesulfonic acid (MOPS) | Fisher | BP308 | To buffer RPMI 1640 | |
| Phosphate buffered saline, PBS | Sigma | P4417 | Buffer for washes | |
| XTT sodium salt | Sigma | X4251 | See above for preparation instructions | |
| Ringer’s lactate | Hospira | NDC0409-7953-09 | For preparation of XTT solution | |
| Menadione | Sigma | M5625 | Caution: hazardous by skin contact, inhalation or ingestion | |
| Petri dishes | Fisher | 08-757-12 | ||
| 15 ml conical centrifuge tubes | Corning | 430790 | ||
| 50 ml conical centrifuge tubes | Corning | 430828 | ||
| 96 well microtiter plates: Polystyrene, flat-bottomed, tissue culture treated | Corning | 3595 | ||
| Multichannel pipette and tips | Eppendorf | |||
| Incubator | Any | |||
| Microtiter plate reader | Any |
References
- Bachmann, S. P. In vitro activity of caspofungin against Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 46, 3591-3596 (2002).
- Hawser, S. P., Norris, H., Jessup, C. J., Ghannoum, M. A. Comparison of a 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]-2H-t etrazolium hydroxide (XTT) colorimetric method with the standardized National Committee for Clinical Laboratory Standards method of testing clinical yeast isolates for susceptibility to antifungal agents. J Clin Microbiol. 36, 1450-1452 (1998).
- Kuhn, D. M., Balkis, M., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Uses and limitations of the XTT assay in studies of Candida growth and metabolism. J Clin Microbiol. 41, 506-508 (2003).
- Kuhn, D. M., George, T., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Antifungal susceptibility of Candida biofilms: Unique efficacy of amphotericin B lipid formulations and echinocandins. Antimicrob. Agents Chemother. 46, 1773-1780 (2002).
- Nobile, C. J., Mitchell, A. P. C. albicans transcription factor Bcr1p: a regulator of cell-surface genes and biofilm formation. Current Biol. 15, 1150-1155 (2005).
- Ramage, G., Saville, S. P., Thomas, D. P., Lopez-Ribot, J. L. Candida biofilms: an update. Eukaryot Cell. 4, 633-638 (2005).
- Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., p, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).
- Bachmann, S. P. Antifungal combinations against Candida albicans biofilms in vitro. Antimicrob Agents Chemother. 47, 3657-3659 (2003).
- Ramage, G., VandeWalle, K., Bachmann, S. P., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. In vitro pharmacodynamic properties of three antifungal agents against preformed Candida albicans biofilms determined by time-kill studies. Antimicrob Agents Chemother. 46, 3634-3636 (2002).
- Ramage, G., VandeWalle, K., Wickes, B. L., López-Ribot, J. L. Characteristics of biofilm formation by Candida albicans. Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).
- Tellier, R., Krajden, M., Grigoriew, G. A., Campbell, I. Innovative endpoint determination system for antifungal susceptibility testing of yeasts. Antimicrob Agents Chemother. 36, 1619-1625 (1992).
- Nett, J., Andes, D. Candida albicans biofilm development, modeling a host-pathogen interaction. Curr Opin Microbiol. 9, 340-345 (2006).
