Ein 96-well Mikrotiterplatte-basierten Methode zur Überwachung der Formation und antimykotische Empfindlichkeitsprüfung von Candida albicans Biofilme
Summary
Wir beschreiben eine einfache, schnelle und robuste Methode für die Bildung von<em> Candida albicans</em> Biofilmen mit 96 well Mikrotiterplatten und seinen Nutzen in antimykotische Empfindlichkeitsprüfung von Zellen in Biofilmen.
Abstract
Candida albicans bleibt die häufigste Ursache von Pilzinfektionen in einem expandierenden Bevölkerung gefährdet Patienten und Candidiasis ist jetzt das dritte häufigste Infektion in US-Krankenhäusern. Unterschiedliche Erscheinungsformen von Candidiasis sind mit Biofilmbildung, sowohl auf dem Host-Gewebe und / oder medizinische Geräte (zB Katheter) verbunden. Biofilmbildung führt negativen klinischen Folgen, wie Zellen innerhalb des Biofilms von der Host-Immunantwort und durch die Einwirkung von Antimykotika sind geschützt. Wir haben eine einfache, schnelle und robuste In-vitro-Modell für die Bildung von C entwickelt albicans Biofilmen mit 96 well Mikrotiterplatten, die auch für Biofilm antimykotische Antibiogramm eingesetzt werden können. Die Anzeige dieses Tests kolorimetrisch, basierend auf der Reduktion von XTT (a Tetrazoliumsalz) durch metabolisch aktive Pilz Biofilm-Zellen. Ein typisches Experiment dauert ca. 24 h für die Bildung von Biofilmen, mit einer zusätzlichen 24 h für antimykotische Empfindlichkeitsprüfung. Aufgrund seiner Einfachheit und die Verwendung von allgemein verfügbaren Labor-Materialien und Geräte, demokratisiert diese Technik Biofilm-Forschung und stellt einen wichtigen Schritt in Richtung Standardisierung der antimykotischen Empfindlichkeitstestung von Pilzen Biofilmen.
Protocol
Discussion
Hier beschreiben wir eine einfache, schnelle, kostengünstige und hoch reproduzierbare 96-well Mikrotiterplatte Modell für die Bildung von Candida Biofilmen mit einer kolorimetrischen Methode, die die Stoffwechselaktivität der Zellen Maßnahmen innerhalb des Biofilms mit XTT gekoppelt. Diese 96-well Mikrotiterplatte Modell für die Bildung von Biofilmen wurde ursprünglich für C entwickelt albicans, aber auch für andere Candida spp verwendet werden. und einfach für andere pilzlic…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biofilm-bezogenen Arbeit im Labor wird durch Zuschüsse finanziert nummeriert R21DE017294 und R21AI080930 vom National Institute of Dental & Craniofacial Forschung und dem Nationalen Institut für Allergien und Infektionskrankheiten (zum JLL-R.). Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die offizielle Meinung der NIDCR, die NIAID oder die NIH.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Sabouraud-dextrose agar | Becton Dickinson | 211584 | To prepare plates for fresh subcultures of fungal isolates | |
| YPD: Yeast peptone dextrose | US Biological | Y2076 | Medium for propagation of overnight liquid cultures | |
| RPMI-1640 without sodium bicarbonate supplemented with L-glutamine | Cellgro | 50-020-PB | Liquid medium for biofilm formation | |
| Morpholinepropanesulfonic acid (MOPS) | Fisher | BP308 | To buffer RPMI 1640 | |
| Phosphate buffered saline, PBS | Sigma | P4417 | Buffer for washes | |
| XTT sodium salt | Sigma | X4251 | See above for preparation instructions | |
| Ringer’s lactate | Hospira | NDC0409-7953-09 | For preparation of XTT solution | |
| Menadione | Sigma | M5625 | Caution: hazardous by skin contact, inhalation or ingestion | |
| Petri dishes | Fisher | 08-757-12 | ||
| 15 ml conical centrifuge tubes | Corning | 430790 | ||
| 50 ml conical centrifuge tubes | Corning | 430828 | ||
| 96 well microtiter plates: Polystyrene, flat-bottomed, tissue culture treated | Corning | 3595 | ||
| Multichannel pipette and tips | Eppendorf | |||
| Incubator | Any | |||
| Microtiter plate reader | Any |
References
- Bachmann, S. P. In vitro activity of caspofungin against Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 46, 3591-3596 (2002).
- Hawser, S. P., Norris, H., Jessup, C. J., Ghannoum, M. A. Comparison of a 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]-2H-t etrazolium hydroxide (XTT) colorimetric method with the standardized National Committee for Clinical Laboratory Standards method of testing clinical yeast isolates for susceptibility to antifungal agents. J Clin Microbiol. 36, 1450-1452 (1998).
- Kuhn, D. M., Balkis, M., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Uses and limitations of the XTT assay in studies of Candida growth and metabolism. J Clin Microbiol. 41, 506-508 (2003).
- Kuhn, D. M., George, T., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Antifungal susceptibility of Candida biofilms: Unique efficacy of amphotericin B lipid formulations and echinocandins. Antimicrob. Agents Chemother. 46, 1773-1780 (2002).
- Nobile, C. J., Mitchell, A. P. C. albicans transcription factor Bcr1p: a regulator of cell-surface genes and biofilm formation. Current Biol. 15, 1150-1155 (2005).
- Ramage, G., Saville, S. P., Thomas, D. P., Lopez-Ribot, J. L. Candida biofilms: an update. Eukaryot Cell. 4, 633-638 (2005).
- Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., p, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).
- Bachmann, S. P. Antifungal combinations against Candida albicans biofilms in vitro. Antimicrob Agents Chemother. 47, 3657-3659 (2003).
- Ramage, G., VandeWalle, K., Bachmann, S. P., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. In vitro pharmacodynamic properties of three antifungal agents against preformed Candida albicans biofilms determined by time-kill studies. Antimicrob Agents Chemother. 46, 3634-3636 (2002).
- Ramage, G., VandeWalle, K., Wickes, B. L., López-Ribot, J. L. Characteristics of biofilm formation by Candida albicans. Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).
- Tellier, R., Krajden, M., Grigoriew, G. A., Campbell, I. Innovative endpoint determination system for antifungal susceptibility testing of yeasts. Antimicrob Agents Chemother. 36, 1619-1625 (1992).
- Nett, J., Andes, D. Candida albicans biofilm development, modeling a host-pathogen interaction. Curr Opin Microbiol. 9, 340-345 (2006).
