림프구 확산을 모니터 Carboxyfluorescein 디아 세 테이트 Succinimidyl 에스터 (CFSE)의 사용

1) 시약 설정 1.1) CFSE 주식 솔루션 CFSE의 염료는 일반적으로 25 MG의 튜브에 carboxyfluorescein 디아 세 테이트 succinimidyl 에스테르 (CFDA, SE) (MW 557.47 g / 두더지)로 구입합니다. (몇 개월 -20 ° C에서 50-100 μL aliquots로 저장) 5 mm의 최종 주식 솔루션 8.96 ML DMSO에 25 밀리그램을 디졸브. 이 같은 노출은 저장하는 동안 피해야하는 것이 중요하므로 CFDA, SE는 수용액과 반​​응합니다. 1.2) Lymphocytes 마우스의 비장 및 또는 림프절에서 lymphocytes 격리하고 함께 문화 매체 1 ML (예 : RPMI)에 resuspend 5% 열 inactivated (HI) 사이 0.5 × 10 6 세포 농도와 태아 송아지 혈청 (FCS), – 10 X 10 7 / ML. 2) CFSE 라벨 2.1) 정기 방법 : 완전히 새로운 (비 침수) 10 ML 원뿔 튜브의 바닥에 신중하게 중간과 장소의 하나 ML 볼륨에서 세포를 resuspend. (비 침수 튜브를 사용하여 이동하고 성급하게 CFDA, SE 솔루션을 혼합에서 한 ML – 세포 현탁액을 방지합니다) 수평 튜브를 놓는다. 조심스럽게 그것은 세포 솔루션과의 접촉을하지 않는 보장 튜브의 상단에있는 플라스틱 이외의 침수 부분에 PBS 110 μL를 추가합니다. 110 μL PBS에 CFDA, SE의 5 MM 주식 1.1 μL를 Resuspend. 신속 튜브 뚜껑 및 솔루션의 빠른 혼합 제복을 얻으려면 잘 반전하고 와동. CFSE의 염료 5 μm의의 최종 농도에됩니다 그러나, 최적 농도는 준비 각 배치에 대해 결정 할 수 있습니다, 그리고 그것이 효과가 있도록 6 개월마다 검사. 상온에서 5 분 세포를 품어. CFSE에 CFDA, SE의 전환시 (토론 참조) 염료는 형광등과 과도한 빛에 노출에 의해 표백에 따라서 경향이된다고합니다. 그러므로, 그것은 알루미늄 호일로 덮고하여 예를 들어,이 시점에서 빛으로부터 튜브를 보호하는 것이 좋습니다. 20 ° C와 폐기 뜨는에서 5 분 300 XG에서 원심 분리에 의해 sedimenting, 20 ° C PBS 5 % HI FCS를 포함 10 권 diluting하여 세포를 씻으십시오. 두 번 더 씻어 반복합니다. (10도 이상의 휴대 전화 번호에 적합한 2.2) 대체 방법 – 30 X 10 7) : 1 PBS의 ML 신속하게 철저히 resuspended 세포 1 ML에 추가하기 위해 5 MM 주식 2 μL를 추가하여 2 X (10 μm의) CFDA, SE 솔루션을 준비하고 신속하게 튜브를 뚜껑과 반전 잘 소용돌이하려면 빠르고 균일 혼합. 상온에서 5 분 세포를 품어 및 단계 2.1 (F) 및 2.1 (G)에서와 같이 씻으십시오. 2.3) 전지는 다음 세포 분열의 유도에 대한 관심이 프로토콜에 적용할 수 있습니다. 라벨 세포는 체외에서 생체내의 assays에서 모두 사용할 수 있습니다. 2.4) 확산 분석의 완성에 세포가 수확되고 (대표 예제 아래 참조) 유동세포계측법으로 분석했다. 3) 대표 결과 CFSE 희석하여 림프구 증식을 평가하기 위해서는 본격적 세포 (즉, 최대 형광)이 아닌 표시된 셀 (예 : 최소 형광)의 형광을 알고 유용합니다. 따라서 귀하의 실험 설계는 계정에 이러한 컨트롤을해야합니다. 다음은 체외에서 유동세포계측법에 의해 CD8 + T 세포의 분열을 측정하는 CFSE를 사용하여 생체내 assays에의 예입니다. 시험 관내 자극에서 3.1) 그림 1의 CFSE 프로필을 보여줍니다 CFSE – 라벨 ovalbumin (OVA) – 구체적인 T 세포 수용체 유전자 변형 OVA의 다양한 양의와 펄스 돌기 세포 3 일 문화 이후 CD8 + OT – I T 세포. CD8 + OT – I 생쥐의 비장과 림프 노드에서 정화 T 세포가 CFSE 및 3.3 X 10 4 DC와 교양 1 X 10 5 세포로 분류되었습니다. DC 어디 3​​7 1 시간에 대한 OVA ° C와 펄스와 문화 두 번 씻어 사전. 후 3 일 수확 및 레이블 방지 CD8 – APC 항체와 Hoechst 33258와 다음 유동세포계측법 (50000 이벤트가 수집)에 의해 분석 셀. 라이브는 (Hoechst 33258 -) CD8 + 세포가 표시됩니다. 비 표시된 세포가 자동 형광 세포가 감지 세포 분열의 한계를 보여줍니다 동안의 컨트롤로, 혼자 교양 CD8 + T 세포는, 비 나누어 세포의 CFSE 강도를 보여줍니다. 4 CFSE의 봉우리가 셀 3 부문까지받은 것을 나타내는이 예제에서 패널의 각 볼 수 있습니다. 생체내 자극에서 3.2) 그림 2는 생체내 3 일 후에 유전자 변형 CD8 + OT – I T 세포 CFSE – 분류 OVA 특정 T 세포 수용체의 CFSE 프로필을 보여줍니다 IN 20 μg의 OVA의 존재. CD8 + CD45.1 congenic OT – I 생쥐의 비장과 림프 노드에서 정화 T 세포가 CFSE 5 X 10 6 세포 C56BL/6J의 측면 꼬리 정맥 (CD45.2 +) 마우스로 IV를 주입으로 표시되었습니다. 2 시간 후 마우스 OVA 20 μg과 IV 주입했다. 삼일 후, 생쥐의 spleens는 안티 – B220 – PerCP, 안티 – CD8 – APC – Cy7 및 안티 CD45.1 – PE – Cy7 항체와 Hoechst 33258로 표시된, 단일 세포 현탁액으로 만든 수집하고 분석했다 유동세포계측법에 의해 (1,000,000 이벤트가 수집). 라이브 (Hoechst 33258는 -) B220 – 세포가 오른쪽 패널에 표시되는 왼쪽 패널과 문이 CD8 + CD45.1 + 세포에 표시됩니다. 컨트롤로, unstimulated CD8 CFSE – 표시 + T 세포가 아닌 나누어 세포의 CFSE 강도를 보여줍니다, 이외의 레이블이 붙은 세포가 세포가 감지 세포 분열의 한계의 자동 형광을 보여줍니다하는 동안. CD45 allotypic 차이의 사용이 전송 CD8를 해결 + 호스트에서 T 세포를, 그들은 전체 CD8 + T 세포 (왼쪽 패널)의 사소한 일부 아르로 매우 중요합니다. 대부분의 세포는 세포가 6 부문까지받은 것을 나타내는 예제 (오른쪽 패널) 7 CFSE의 봉우리 이내에 가을 있습니다. 그림 1. CFSE – 라벨 ovalbumin (OVA) – 구체적인 T 세포 수용체 유전자 변형 CD8 OVA의 다양한 농도와 펄스 DC로 체외에 대응 + OT – I T 세포, 삼일 문화 뒤에되고 그림 데이터. 참고 CD8가 아닌 나누어 인구 + T 능력 항원 (밝은 회색의 히스토그램)와 비 표시된 인구 (어두운 회색 히스토그램)의 자동 형광의 부재에서 세포. 그림 CD8을 모습 + 높은 항원 농도에 나누어 더 많은 T 세포와 CFSE 희석 봉우리에 따라 1-3 회 분할이 T 세포. 그림 2. 능력 CFSE – 라벨 ovalbumin (OVA) – 특정 adoptively OVA에 대응하는 C57BL / 6 마우스에 양도 T 세포 수용체 유전자 변형 CD8 + OT – I T 세포, 입양이 완료된 후 삼일 표시된 데이터는 왼쪽 패널 :. CD8 +, CD45. 받는 마우스 1 + OT – 1 T 세포. 오른쪽 패널 : CFSE 확산 프로필. CD8가 아닌 분할 인구 참고 +받는 생쥐의 T 세포는 항원 (밝은 회색의 히스토그램)와 비 표시된 lymphocytes (어두운 회색 히스토그램)의 자동 형광을받지 않습니다. 그림 CFSE 희석 봉우리에 따라 1-6 번 나누어 가지고 CD8 + T 세포를 묘사. 그림 3. carboxyfluorescein 디아 세 테이트 succinimidyl 에스테르 (CFDA, SE)와 함께 세포의 라벨 중에 발생하는 여러 가지 분자 이벤트의 표현. 프로세스에 대한 자세한 내용은 토론 텍스트를 참조하십시오. 참고 : 일반적인 약어 'CFSE'가 아닌 CFDA, SE는 일반적으로 라벨 시약 및 라벨 절차를 설명하는 데 사용됩니다. 파리쉬 4 기반의 그림.