Antigen-spezifische In Vivo Killing-Assay mit CFSE markierten Zielzellen
Summary
Viele Infektionen auslösen eine starke CTL-Antwort, aber gelegentlich, die Menge der reagierenden Zellen nicht korrelieren mit der Bekämpfung von Krankheitserregern,<sup> 1</sup>. Ein Maß für CTL Qualität ist ihre Fähigkeit, spezifisch abtöten<sup> 2</sup>. CFSE Markierung von Zielzellen kann verwendet werden, um diese CTL-Antwort Qualität zu untersuchen<em> In vivo</em<sup> 3,4</sup>.
Abstract
Carboxyfluoresceindiacetat Succinimidylester (CFSE) können verwendet werden, um einfach und schnell Etikett einer Zellpopulation von Interesse für die in vivo Untersuchung. Diese Kennzeichnung ist klassisch benutzt worden, um die Proliferation und Migration zu studieren. In dem hier vorgestellten Verfahren haben wir die Zeitachse nach adoptiven Transfer auf das Überleben und die Tötung von Epitop-spezifischen CFSE markierten Zielzellen 4-6 aussehen verkürzt. Die Höhe der spezifischen Tötung eines CD8 + T-Zell-Klon kann zeigen die Qualität der Antwort, da ihre Menge kann irreführend sein. Spezifischen CD8 + T-Zellen können sich funktionell erschöpft im Laufe der Zeit mit einem Rückgang der Produktion von Zytokinen und Töten 7,8. Auch können bestimmte CD8 + T-Zell-Klonen nicht so gut wie andere zu töten mit unterschiedlichen TCR Besonderheiten 9. Für eine effektive zellvermittelte Immunität (CMI), muss Antigene identifiziert, die produzieren nicht nur eine ausreichende Anzahl von T-Zellen reagieren, sondern auch funktionell robust reagieren T-Zellen. Hier bewerten wir die Prozent-Zell-spezifische Tötung von zwei Peptid-spezifischen T-Zell-Klone in BALB / c Mäusen.
Protocol
Discussion
Dieser Test kann geändert werden, um die proliferative Kapazität von Zellen, einschließlich klonale Expansion untersucht werden, weil CFSE teilt relativ gleichmäßig auf Nachkommenschaft 10,11. Es ist auch möglich, CFSE Kennzeichnung zu verwenden, um die Zellwanderung 6,12 untersuchen, obwohl es andere Zelle Tracing-Verfahren, die besser geeignet sein kann je nach Hypothese, z. B. Tetramere und Biolumineszenz 13, die ebenfalls mit CFSE Kennzeichnung kombiniert werden kann.
<p cl…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ich möchte Bianca Mothe, Carla Oseroff und Marie-France DelGuercio für ihre Einführung in immunologischen Assays und Maus Umgang danken. Die Arbeit im Labor von GA Splitter wird von NIH 1-RO1-AI-073558, GLRCE gewähren 1-U54-AI-057153, und BARD US-3829-06 finanziert.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 1 mm glass beads | Biospec Products | 11079110 | ||
| 70 μm cell strainer | BD Falcon | 352350 | ||
| 96-well plate | Costar | 3799 | ||
| Adjulite Incomplete Freund’s Adjuvant | Pacific Immunology | n/a | ||
| DMSO | Sigma | D-5879 | ||
| FBS | GIBCO | 16000-077 | ||
| FC 500 Flow Cytometer | Beckman Coulter | n/a | ||
| Kontes glass tissue grinder | Kontes | 885300-0015 | ||
| Mini Beadbeater | Biospec Products | n/a | ||
| Needle | B-D | 305175 | ||
| Parafilm “M” | Pechiney Plastic Packaging | PM992 | ||
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | ||
| PBS | GIBCO | 10010-023 | ||
| PharmLyse lysing reagent | BD Biosciences | 555899 | ||
| RPMI 1640 | GIBCO | 11875-093 | ||
| Syringe | B-D | 309602 | ||
| Vybrant CFSE Kit | Invitrogen (Molecular Probes) | V12883 |
References
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