サブセルラー解像度で手つかずのショウジョウバエの幼虫の in vivoイメージングで

イメージングチャンバーのA）組立選択された段階（25℃で約24時間の観測間隔をあけ° Cの段階を徘徊するまで、例えば初期の第3齢幼虫）の幼虫を選択します。 培養液し、乾燥DABのそれをきれいに水で幼虫をすすぎます。 コー​​トチャンバの底部の要素の中心、ハロカーボンオイルの薄膜で、幼虫に直面する地域。 チャンバー内の顕微鏡対物（神経筋接合部（NMJ）26および27は、イメージを作成することができます）（図1 AE）に面した腹側に幼虫を置く。 グリッド面の上方（図1）の空気のスロットで、油の層の上にプラスチック製のスペーサを置きます。このステップで確認してください：スペーサの高さは約半分の幼虫の直径であり、スリットの幅は、幼虫の約2倍の直径にする必要があります。 顕微鏡でイメージング室を配置幼虫のB）麻酔適切な麻酔装置/気化器とチャンバーの二つのインレットを接続します。 アップフロントを確認してください。 室内空気中のデスフルランの有効濃度は、安全規則によって指定されたものを超えないようにしてください！デスフルランのごくわずかな総容量は、幼虫を麻酔するために必要です。デスフルラン1の15％のアプリケーション（v / v）の実験で使用する理想的な濃度を決定するための良い出発点であることが証明されている。安全上の理由から、我々は、気化器は、in vivoイメージングの2-4時間のために必要以上のデスフルランが含まれてはならないことを示唆している。 水のガラスでチャンバーの出口に接続されたチューブのもう一方の端を浸してから約5秒間チャンバーへの麻酔の流れを制御するバルブを開きます。 このステップで確認してください。 気泡が水に登るのですか？そうでない場合チャンバーは漏れやすいです。 約3秒間のバルブを閉じます。 顕微鏡で残留幼虫の動きを監視します。ハートビートと筋肉の動きの両方を確認してください。幼虫の麻酔が完了するまでに必要なオープンとクローズのバルブは、ステップ8および9で説明されている場合は、すべてのバルブを閉じて、イメージングを起動します。 このステップで確認してください。 残留筋肉の動きやハートビートは、幼虫が適切に麻酔ではないことを示します。完全な麻酔は、高解像度の画像が不可欠です。幼虫は通常、特定の時点よりも長い15〜20分のための麻酔であってはならない。 C）イメージング正しい位置と画像の興味の構造（図2-4）を識別する。 D）麻酔からの回復はイメージングは​​、チャンバー内に空気を聞かせ完了後。 このステップで確認してください。 送信されるハロゲンの光によって幼虫のハートビートと筋肉の収縮を確認してください。筋肉が収縮を始めると、それは、イメージング室から幼虫を削除しても安全です。 麻酔装置からチャンバーを外し、顕微鏡から取り外します。慎重にチャンバーを分解しますとマッシュポテトフライ培養培地に幼虫を置く。 適切な温度でインキュベーター内で料理を保管してください。 E）時系列十分な時間のポイントが得られるまで手順2-14を繰り返します。 代替プロトコル： 幼虫は30分間隔内で複数回撮像する場合には、次の麻酔の時点まで、イメージングチャンバー内にそれを残すために実用的かもしれません。十分な時間のポイントが得られるまで手順7-14を繰り返します。 このステップで確認してください。 幼虫は一度に2時間以上の撮像室内に保持されるものではない、またその時点でより長い15〜20分のための麻酔になることです。 イメージングチャンバーの1アセンブリを示します 。 （A）幼虫と油の層の上にプラスチック製のスペーサを置きます。 （B）、次のスペーサーで22 × 22 mmのカバースリップを置き、チャンバー内にプレキシグラスのガイドリングを挿入する（C）金属リングと幼虫の位置を修正し、（D）チャンバーを閉じます。 （E）今すぐチャンバーは顕微鏡にマウントする準備が整いました。 ショウジョウバエの幼虫の2ボディー壁の筋肉を図 。筋肉やNMJsはCD8 – GFP – SH融合蛋白質8の発現によって可視化した。幼虫にクチクラを通して腹側に焦点を当てたときに観察されるように筋肉が表示されます。 （AC）で最も表面的な筋肉、27は、最も内側の筋肉、6と7は、表示されている（KL）で、示されています。スケールバー：100μmの、スライス間のΔZは2μmである。 ショウジョウバエの幼虫の体壁筋の3アイデンティティを示しています 。 L3 ショウジョウバエの幼虫の筋肉のアイデンティティ、セグメントのA3は、示されている。筋肉やNMJsはCD8 – GFP – SH融合蛋白質8の発現によって可視化した。幼虫にクチクラを通して腹側に焦点を当てたときに観察されるように筋肉が表示されます。 ACで最も表面的な筋肉、27は、表示され、KLで最も内側の筋肉、6と7で、示されています。スケールバー：100μm以下、スライス間のΔZは2μmである。 図ショウジョウバエの幼虫の神経筋接合部の4アイデンティティ 。 （AD）NMJsはDGluRIIA – MRFP融合タンパク質1の発現によって可視化した。幼虫にクチクラを通して腹側に焦点を当てたときに観察されるようにNMJsが表示されます。 （AB）の最も浅NMJ、27日に示されている、CDの中で最もインテリアNMJs、6と7は、表示されます。スケールバー：100μm以下、スライス間のΔZは5μmである。 （E）と（F）表層（E）とより多くのインテリア（F）NMJsのアイデンティティは参照のために与えられます。