L'imagerie de vivo chez la drosophile larves Intact au sub-cellulaire Résolution

A) de l'Assemblée de la chambre de l'imagerie Sélectionnez une larve du stade choisi (par exemple au début 3 ème stade larvaire en laissant un intervalle d'observation d'environ 24 heures à 25 ° C jusqu'à errance scène). Rincer la larve à l'eau pour le nettoyer du milieu de culture et de la limande sécher. Enduire le centre de l'élément de fond de la chambre, dans la région pour faire face à la larve, avec un mince film d'huile sur les halocarbures. Mettez la larve avec la face ventrale face à l'objectif du microscope dans la chambre (permet jonction neuromusculaire (JNM) 26 et 27 à imager) (figure 1 AE). Placer l'entretoise en plastique sur la couche d'huile, avec les fentes d'air de la face vers le haut de grille (Figure 1). S'il vous plaît vérifier à cette étape: La hauteur de la cale est à peu près la moitié du diamètre des larves, la largeur de la fente doit être environ deux fois le diamètre de la larve. Placez la chambre d'imagerie sur le microscope B) Anesthésie de la larve Relier les deux entrées de la chambre avec une anesthésie appropriée périphérique / vaporisateur. S'il vous plaît vérifier à l'avance: La concentration efficace de desflurane dans la salle de l'air ne devrait jamais dépasser celle spécifiée par les règlements de sécurité! Seul un très petit volume total de desflurane est nécessaire pour anesthésier les larves. L'application de 15% (v / v) d'une desflurane s'est avéré être un bon point de départ pour déterminer la concentration idéale pour être utilisée dans une expérience. Pour des raisons de sécurité nous suggérons que le vaporisateur ne devrait jamais contenir plus que nécessaire desflurane pour 2-4 heures de l'imagerie in vivo. Immerger l'autre extrémité du tube fixé à la sortie de la chambre dans un verre d'eau, puis ouvrir les vannes de régulation du débit de l'anesthésique dans la chambre pendant environ cinq secondes. S'il vous plaît vérifier à cette étape: Ne bulles d'air montent dans l'eau? Si ce n'est pas la chambre est percé. Fermer les vannes pendant environ trois secondes. Surveiller les mouvements résiduels de larves dans le microscope. Vérifiez la fois le rythme cardiaque et les mouvements musculaires. Si nécessaire soupapes s'ouvrent et se ferment comme décrit dans l'étape 8 et 9 jusqu'à ce que l'anesthésie de la larve est terminée, puis fermez tous les robinets et commencer l'imagerie. S'il vous plaît vérifier à cette étape: Mouvements musculaires résiduelles ou pouls indique que la larve n'est pas correctement anesthésié. Anesthésie complète est vitale pour des images haute résolution. La larve ne devrait normalement pas être anesthésiés pendant plus de 15-20 minutes à une heure donnée. C) Imagerie Identifier la position correcte et l'image de la structure d'intérêt (figure 2-4). D) La récupération d'une anesthésie Après l'imagerie est terminée laisser entrer l'air dans la chambre. S'il vous plaît vérifier à cette étape: Vérifiez les contractions musculaires et des battements de cœur de la larve par une lumière halogène transmis. Comme les muscles commencent traitance qu'il est sécuritaire d'enlever la larve de la chambre de l'imagerie. Détachez la chambre de l'appareil anesthésie et de le retirer du microscope. Démonter la chambre avec soin et placez la larve dans un milieu de culture de volée écrasée. Rangez la vaisselle dans un incubateur à la température appropriée. Séries E) Répétez la procédure jusqu'à 2-14 points de temps suffisantes ont été obtenues. Alternative protocole: Si la larve est à imager plus d'une fois dans un intervalle de 30 minutes il peut être pratique de le laisser dans la chambre d'imagerie jusqu'au point de temps anesthésie prochaine. Répétez la procédure jusqu'à 7-14 points de temps suffisantes ont été obtenues. S'il vous plaît vérifier à cette étape: La larve est de ne pas être conservé dans la chambre de l'imagerie depuis plus de deux heures à la fois, ni d'être anesthésiés pendant plus de 15-20 minutes à une heure. La figure 1 de l'Assemblée de la chambre de l'imagerie. (A) Placer la larve et l'entretoise en plastique sur la couche d'huile. (B) Placez un 22 x 22 mm lamelle sur l'entretoise et insérez la bague de guidage en plexiglas dans la chambre, à côté (C) fixer la position de la larve avec l'anneau de métal et (D) à proximité de la chambre. (E) Maintenant, la chambre est prête à être montée sur le microscope. Figure 2 Corps-mur muscles de larves de drosophile. Muscles et NMJs ont été visualisées par l'expression d'une protéine de fusion GFP-CD8-Sh 8. Les muscles sont présentés comme observé lors de la focalisation à la face ventrale à travers la cuticule dans la larve. Dans (AC) le muscle le plus superficiel, 27 ans, est montré, dans (KL) les muscles les plus intérieurs, 6 et 7, sont représentés. Barre d'échelle: 100 um, Az entre deux tranches est de 2 um. Figure 3 Identité de tégument muscles de larves de drosophile. L'identité des muscles en L3 drosophile larves, A3 segment, est montré. Muscles et NMJs ont été visualisées par l'expression d'une protéine de fusion GFP-CD8-Sh 8. Les muscles sont affichés comme observé lors de la focalisation à la face ventrale à travers la cuticule dans les larves. En AC le muscle le plus superficiel, 27 ans, est montré, dans KL les muscles les plus intérieurs, 6 et 7, sont représentés. Barre d'échelle: 100 um, Az entre deux tranches est de 2 um. Figure 4 Identité des jonctions neuromusculaires des larves de drosophile. (AD) NMJs ont été visualisés par expression d'une protéine de fusion DGluRIIA-MRFP 1. Le NMJs sont présentés comme observé lors de la focalisation à la face ventrale à travers la cuticule dans la larve. Dans (AB) le plus superficiel JNM, 27 ans, est montré, dans le CD du NMJs plus intérieure, 6 et 7, sont représentés. Barre d'échelle: 100 um, Az entre deux tranches est de 5 um. (E) et (F) l'identité du superficiel (E) et plus intérieure (F) NMJs est donnée à titre de référence.