Preparazione del Cuore Rat altamente Accoppiato mitocondri

Introduzione Mitocondri di cuore di ratto è una delle preparazioni più comuni per gli studi passati e presenti del metabolismo cellulare. Essi possono essere ottenuti in modo rapido e affidabile in grande quantità dal tipo selvaggio o animali knock-out. La procedura generale consiste di digestione del tessuto dalla tripsina, il frazionamento e centrifugazione differenziale. Ci sono diverse condizioni che devono essere tenuti in isolamento dei mitocondri da vari tessuti, compreso il cuore (Fig. 1). Il tessuto deve essere accuratamente tritata, in quanto influisce direttamente sulla produzione dei mitocondri ottenuti. Tessuto cardiaco è meglio tritare con piccole forbici curve e può essere seguita da utilizzare una smerigliatrice Latapie tessuto o, se un macinino tessuto non è disponibile, una pressa aglio con fori di diametro di uscita di circa 1,0 mm di diametro. E 'necessario mantenere la temperatura delle soluzioni ad ogni passo. Pertanto l'intera procedura deve essere effettuata in una stanza fredda e tutti gli strumenti e le soluzioni devono essere preparati e raffreddato in anticipo. Se le condizioni di temperatura non sono mantenuti stabili varie proprietà della preparazione può essere perso. Struttura mitocondriale è molto sensibile al gelo così overfreezing della sospensione (per esempio durante la centrifugazione) non è consentito, specialmente se gli studi di trasporto attivo sono importanti. Un parametro importante è il tempo-durata della procedura, l'isolamento deve essere eseguita il più rapidamente possibile e la preparazione ottenuto deve essere utilizzato immediatamente. Pertanto, strumenti chirurgici, le soluzioni e gli apparecchi devono essere preparati in anticipo. Materiali e strumenti Strumenti Dritti forbici operativo, punta aguzza Forbici curve Forcipe Scatola di Petri Piccolo imbuto + pezzo di nylon filtro (lavata) 6 bicchieri da 50 ml Due agitatori magnetici e due bagni di ghiaccio Un bagno di ghiaccio grande 2 barre magnetiche piccoli Spatole per raschiare pellet Centrifuga tubi Stampa del tessuto Latapie (può essere sostituito con stampa aglio) Teflon-vetro omogeneizzatori 20ml e 1-2ml Rifiuti coppa Provette Eppendorf per la finale sospensione mitocondriale e campioni per la determinazione delle proteine Bagni di ghiaccio Le soluzioni (calcolato per 2 ratti): Soluzione di lavaggio: 0,3 M saccarosio, 10 HEPES mM (pH = 7,2), 0,2 mM EDTA (1000 ml) Isolamento tampone: 0,3 M saccarosio, 10 HEPES mM (pH = 7,4), 0,2 mM EDTA, 1 mg / ml di BSA (Sigma A6003) (preparato dal buffer di lavaggio 100 ml). BSA può essere sostituito da meno costosa grassi acidi analoghi. Lo stesso buffer o le sue variazioni isotonica può essere utilizzata come buffer di risospensione. Tripsina (Sigma T8003) soluzione: 2.5mg/ml a 1 mM HCl (0,5 ml) Tripsina inibitore di soia (Sigma T9128) 6,5 mg/10 ml di tampone di isolamento Protocollo Lo schema generale della procedura è riportato in fig. 1. Cuore deve essere raffreddato e lavato in tampone di lavaggio, il tessuto asportato ventricolare, tritato e omogeneizzato fotolitica durante il trattamento con tripsina. La sospensione è centrifugata a bassa velocità e il supernatante ottenuto viene centrifugato di nuovo alle alte velocità per raccogliere mitocondri. A seconda degli esperimenti previsti nel buffer risospendere può essere sostituito da qualsiasi altra soluzione isotonica. Gli animali sono stati terminati in conformità con il Regno Unito "Animali (procedure scientifiche) Act". dalla dislocazione cervicale seguita da decapitazione. E 'necessario estrarre il cuore subito dopo la decapitazione dell'animale, in modo che non vi è alcun ritardo tra la fine degli animali e di estrazione del cuore. Se l'isolamento parallelo di fegato mitocondri si aspetta i ratti vanno lasciati a digiuno durante la notte prima dell'esperimento. Preparare tre bicchieri contenenti 40 ml di tampone di lavaggio. Raffreddarli nel ghiaccio-sale da bagno da 3 a 5 minuti prima di procedere alla fase successiva. Assicurarsi di non overfreeze e utilizzare immediatamente subito dopo nuvole di cristalli di ghiaccio iniziano a comparire. Aprire il torace del ratto decapitato ed estrarre il cuore. Fare piccole incisioni e poi subito a trasferire il cuore alla gelida soluzione nel becher prima. Spremere il cuore per rimuovere il sangue e lo mise nel secondo becher. Ripetere questa operazione per ogni cuore. Secco il cuore sulla carta da filtro. Togliere tutto il grasso, sangue rappreso, orecchiette e fasce e la piscina del tessuto ventricolare. Tritare il tessuto in pool con piccole forbici curve sul piatto di Petri in ghiaccio per circa 5 minuti fino a quando la dimensione delle particelle è di circa 1-2 mm. Mettere il trito in tessuto la stampa dei tessuti e passareattraverso. Essere consapevoli del fatto che una notevole quantità di materiale può rimanere sulla stampa in modo da raccogliere tutto il tessuto cardiaco dalle pareti e fondo della stampa. Trasferire il materiale nel becher con 50 ml di tampone di lavaggio e mescolate. Quindi filtrare la sospensione attraverso un filtro di nylon. Lavare il tessuto tritato sul filtro 3 volte con il tampone di lavaggio e scartare il filtrato. Trasferire il tessuto lavato in 20 ml di tampone di lavaggio e posizionarlo nel bagno di ghiaccio sul agitatore magnetico. Aggiungere 0,5 ml di soluzione di tripsina sotto agitazione costante e avviare il timer. Preparare un altro agitatore magnetico, bagno di ghiaccio e un secondo 50 bicchiere ml. Sul 4 ° minuto brevemente omogeneizzare la porzione sospensione da parte con un piccolo vagamente dotato di vetro teflon omogeneizzatore (10-15ml) con diversi colpi su e giù per disperdere la sospensione. Dopo omogeneizzazione trasferire la sospensione nel becher secondo. Ripetere la procedura per il 9 ° minuto, in modo da eseguire l'omogeneizzazione della sospensione due volte in totale. Dopo 15 min di incubazione, aggiungere 10 ml di isolare tampone contenente inibitori della tripsina e incubare per 1 min. Filtrare la sospensione di nuovo attraverso un filtro di nylon e salvare il filtrato. Raccogliere la frazione di particolato a sinistra su un filtro e omogeneizzare per 1 min a 15-20 ml di tampone di lavaggio. Combina l'omogeneizzato con il filtrato e centrifugare per 15 minuti a 600g. Con attenzione filtrare il supernatante risultante in una provetta da centrifuga nuovo. Evitare la contaminazione del pellet e centrifugare ancora per 15 minuti a 8500g. Dopo la centrifugazione ad alta velocità scartare il surnatante e lavare il pellet di 2-3 volte con 1 ml di buffer di scartare il soffice strato bianco bordo esterno. Spezzare il pellet con la spatola, ma evitare la macchia rossa di eritrociti in basso. Se le cellule del sangue ottenuto Loos, rimuovere i bit rossi dalla sospensione prima di omogeneizzazione. Risospendere il pellet con un piccolo omogeneizzatore o, in alternativa pipettando gentile. Diluire la sospensione con più Isolationbuffer e centrifugare ancora per 15 minuti a 8500g. Eliminare il surnatante, risospendere il pellet in risospensione tampone (un buffer isotonica di scelta) e centrifugare di nuovo. La risultante marrone pellet contiene lavato mitocondri intatti. Risospendere il pellet in un volume molto piccolo di tampone isotonica di vostra scelta. Figura 1. Schema dimostrando la procedura passo-passo di isolamento del cuore di ratto mitocondri. Parte superiore, Fasi 1-9: disgregazione del tessuto, il trattamento tripsina e omogeneizzazione; parte inferiore, tappe 10-15: centrifugazione differenziale.