אנו מתארים פרוטוקול а עבור בידוד של לב טהור בשילוב עכברוש מאוד המיטוכונדריה ללימודי פונקציונליים או מבניים של bioenergetics הסלולר, מדידות biophysical, proteomics או הדנ"א המיטוכונדרי וניתוח שומנים.
הפונקציה של המיטוכונדריה בדור הסלולר של ה-ATP בתהליך של זרחון חמצוני זוכה להכרה רחבה. במהלך העשורים האחרונים חלו התקדמות משמעותית להבנתנו את הפונקציות של אחרים במיטוכונדריה מאשר הדור של אנרגיה. אלה כוללים את תפקידם אפופטוזיס, מתנהג כמו איתות האברונים, פיתוח יונקים ההזדקנות, כמו גם תרומתם תיאום בין מטבוליזם התא ובחלוקה של תאים. ההבנה שלנו של תהליכים ביולוגיים מווסתת על ידי המיטוכונדריה מבוסס על שיטות חזקים בידוד וטיפול של המיטוכונדריה שלם מרקמות של חיות מעבדה. המיטוכונדריה מהלב עכברוש הוא אחד הנפוצים ביותר ההכנות ללימודים בעבר ובהווה של חילוף חומרים התאי, כולל מחקרים על עקום החוצה וחיות.
כאן אנו מתארים שיטה מהירה מפורט עבור בידוד של המיטוכונדריה שלם עם רמה גבוהה של צימוד. הכנה כזו של הלב חולדה המיטוכונדריה הוא אובייקט מצוין עבור מחקר תפקודית מבנית על bioenergetics הסלולר, הובלה של ביומולקולות, מחקרים proteomic וניתוח של דנ"א, חלבונים ושומנים במיטוכונדריה.
פרוטוקול מהיר מפורטות הבידוד של המיטוכונדריה שלם עם רמה גבוהה של צימוד מתואר. הכנה שהושגו יכול לשמש למחקר פונקציונלי או מבניים על bioenergetics הסלולר, מחקרים proteomic או ניתוח הדנ"א המיטוכונדרי ותוכן השומנים. מחקרים Biophysical תחבורה פעילה של יונים ביניים מטבולי ניתן גם לבצע. אפשר להמשיך בתהליך ההכנה המיטוכונדריה כדי לבודד את חלקיקי submitochondrial, הממברנה החיצונית או רכיבים נפרדים לטהר של זרחון חמצוני. השיטה המתוארת הוא שינוי של הפרוטוקול הסטנדרטי של בידוד על ידי יעקובוס ו סאקס 1. התשואה הצפויה של המיטוכונדריה מוכן הוא כ 10-15 מ"ג של חלבון לכל המיטוכונדריה לב ויחס השליטה על הנשימה Malate / גלוטמט הכנה כזה נע בין 8-12 עם הנשימה IV מדינת סביב 0.12 μmol O 2 חלבון xmin xmg -1 -1 ב 23 ° C במדיום המהווים 0.25 סוכרוז M, 10 mM KCl, 0.2 mM EDTA, 5 mM אשלגן זרחתי (pH 8.0) עם 150 מיקרומטר ADP לנשימה חניכה III המדינה (על תנאי הניסוי ותוספות המדויק, לראות נ"צ . 2).
תשומת לב מיוחדת יש לתת פרטים טכניים אחדים לפני תחילת ההליך בבידוד. זה חיוני כדי להשתמש לנקות צינורות פוליפרופילן או פוליקרבונט צנטריפוגות, ולכן צינורות יש לשטוף ביסודיות עם מברשת נקייה ומים חמים, אולם הטיפול אבקת צריך להישמר לכל הפחות. כמו כן, עדיף לאסוף את כל כלי זכוכית וכלי הכרחי בחדר קר יום לפני הבידוד.
במהלך הבידוד בעת העברת מאגרים של צלוחיות על כוסות, תשומת לב מיוחדת а יש לתת למנוע טיפות של מי קרח לתוך הפתרונות. כאשר הטיפול ברקמות יש להדגיש כי עקירת הלב צריך להתבצע בהקדם האפשרי מאז אפילו קצרת זמן העיכוב בין עריפת ראש של החיה וקירור רקמת תביא המיטוכונדריה זוגיים חלקית. קירור מהיר ושטיפת יסודית של לבבות להסיר חיונית כדי להשיג הכנה רגילה, ללא המוגלובין NADase כדורית אדומה.
טריפסין משמש השפלה חלבונים החיבור להגדיל את הרגישות של הרקמות לכפות הגז במהלך homogenisation. חשיפה ממושכת של הרקמה כדי פרוטאז יש להימנע שכן התוצאות במיטוכונדריה של איכות נחותה.
לאחר centrifugations מהירות גבוהה הקירות של צינורות צנטריפוגה יש לנגב עם נייר טישו כדי להסיר כל הפיקדונות של חומר השומן שהצטבר על הקירות.
עבור resuspension הסופי עדיף להשתמש בנפח נמוך של המאגר הסופי על מנת למזער אובדן של פונקציות המיטוכונדריה במהלך האחסון (150-200 μl של המאגר בכל לב). עבור מחקרים של הובלה של קטיונים divalent לא סוכני chelating חייבים להיות נוכחים לקראת הגמר המיטוכונדריה ולכן יש לשטוף כמה פעמים עם המדיום EGTA ללא בשימוש בתוך השעות הראשונות לאחר בידוד.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים פרופ 'וינוגרדוב וד"ר ורה Grivennikova עבור המבוא של המחברים לתחום הביולוגיה המיטוכונדריה תובנות ועצות שימושיות רבות בהליך זה. המחברים מודים לגברת אמנדה McKintock ממשרד התקשורת מאוניברסיטת קווינס על העזרה בהכנת וידאו.