Estimar as taxas de produção de vírus em Sistemas Aquáticos

1. Ultrafiltração da água do mar para gerar "Virus-free" de água (Wilhelm & Poorvin 2001) Cerca de 20L de água do mar / lakewater é coletado como assepticamente possível. A água é serialmente através prefiltered 142 mm de diâmetro em policarbonato 0,8 mM filtros que podem ser mantidos a -20 ° C para análise da comunidade. Filtros de maior tamanho dos poros pode ser usado antes de este passo para sistemas muito produtivos. Para obter água de um ultrafiltrado M12 Amicon sistema (Millipore) de 30 kDa cartucho espiral de corte é usada para excluir todos os vírus, mesmo pequenos vírus RNA. As amostras são processadas e concentradas em ~ 25% a velocidade com ~ 15-16 kPa de contrapressão. A amostra restante de aproximadamente 500 mL de água irá conter uma comunidade vírus concentrado (que pode ser guardado para outras experiências), enquanto os restantes 19,5 L de água livre de vírus será utilizado para ensaios de produção viral. Após cada dia de uso, o M12 Amicon sistema devem ser limpos para evitar danos à membrana do filtro. Se você estiver trabalhando com água do mar, lavar a membrana com, pelo menos, 6L de água Milli-Q seguida por uma lavagem com solução de NaOH 0,1 N por 30-45 minutos. Lavar novamente o cartucho com, pelo menos, 6L de água Milli-Q. Quando terminar de usar o sistema M12, o cartucho espiral deve ser armazenado em um 3 PO 4 0.05MH solução a 4 ° C. 2. Método de Redução do vírus para produção Viral (Wilhelm et al. 2002) Até 500 mL da amostra da água do mar / lakewater com o anfitrião e os vírus são obtidas e colocadas em uma unidade sterifilter com 0,2 mícrons nominal dos poros do tamanho de baixa ligação às proteínas do filtro (por exemplo, Durapore) colocados sobre ele. A amostra é suavemente pressionado a vácuo em <200 mmHg, enquanto continuamente ressuspender a amostra com uma pipeta de transferência estéril para inibir as células bacterianas de se concentrar no filtro. Lentamente, três volumes de ultrafiltrado são adicionados à suspensão bacteriana para reduzir significativamente o número de vírus livre na amostra. A fracção bacteriana é diluído de volta para 500 mL com água livre de vírus e dividido em três repetições de 150 mL cada e são colocados em garrafas de 250ml claro policarbonato. 3. Filtração tangencial Fluxo Método (TFF) para a Produção Viral (Weinbauer et al. 2002, Winget et al. 2005) TFF representa uma abordagem alternativa para o método de redução viral. Aproximadamente 500 mL de amostra natural é coletado como descrito acima. Esta amostra é concentrada através de um 0,2 mícrons nominal dos poros do tamanho de sistema de filtração de fluxo tangencial. Quando a fração de bactérias é reduzida a cerca de 10-15 mL, ultrafiltrado, a água livre de vírus é adicionada e distribuída como acima. As garrafas são incubadas a replicar em condições in situ, usando câmaras ambientais. Níveis de luz são alteradas para as condições da superfície, usando de cor azul de acrílico transparente com acrílico ou screening net para diminuir a intensidade da luz. Temperaturas da superfície do ambiente são muitas vezes obtidos através de um fluxo de água do mar baralho incubadora. Amostras para estimativas de abundância bacteriana e viral são tomadas no tempo 0, com uma concentração final de 2,0-2,5% glutaraldeído estéril adicionado em criotubos. Estas amostras são imediatamente flash congelado com nitrogênio líquido e armazenadas congeladas até ser transformado. Se nitrogênio líquido não estiver disponível, lâminas de microscopia podem ser preparados e transformados imediatamente (ver procedimento abaixo) Subamostras são coletadas a cada 2,5 horas para pelo menos 10 horas pelo método descrito acima. Neste momento a água pode ser recolhida para análise de PCR quantitativo. Até 5 mL da amostra pode ser adicionado a uma cryovial com nenhum agente fixador com congelamento de flash imediata em nitrogênio líquido. 4. Microscopia de Produção viral (Noble & Fuhrman 1998, Wen et al. 2004) Amostras congeladas a ser 0,02 mM filtrada para microscopia devem ser descongeladas no gelo. Prepare uma solução estoque de SYBR Green diluindo a 1:10 solução estoque com água estéril. Em seguida, a partir da solução estoque, preparar uma solução de trabalho, adicionando 1 ml da solução estoque para 39 mL de água estéril. A glicerol a 50%, 50% de fosfato tamponado soluções salinas (PBS, 0,05 M Na 2 HPO 4, 0,85% NaCl, pH 7,5) e solução estoque fresco de 2,5% de p-fenilenodiamina também deve estar preparado antes de começar. Manter os 50% glycerol/50% de solução PBS a 4 ° C e os p-phenylenediamine estoque a -20 ° C no escuro até de partida. Direito antes de adicionar a filtragem p-fenilenodiamina ao PBS 50% glycerol/50% para uma concentração final de 0,1% para ser utilizado como a solução Antifade. Coloque um de 25 mm 0,02 mícrons filtro Anodisc em cima de um MicronStep 0,45 mícrons, filtro backing celulósico. Adicionar 850 mL da amostra fixa para o topo da Anodisc e vácuo de 20 pKa até que esteja completamente seco. ML colocar 100 de SYBR solução Verde trabalhando para uma placa de Petri estéril e, com o vácuo ainda sobre, remova cuidadosamente a Anodisc a partir da torre do filtro e colocar on the Green SYBR. Incubar as amostras no escuro à temperatura ambiente por 20 minutos. Remova cuidadosamente o filtro da solução Verde SYBR e pavio parte de trás do filtro com um Kimwipe para remover todas as corante residual. Se desejar, o retorno do filtro para a torre e passar até 800 mL de 0,02 mícrons água filtrada ou meios estéreis através do filtro para enxaguar mancha excesso. Adicionar uma pequena gota de solução Antifade a uma lâmina de microscópio e coloque uma lamínula por cima. Remover a lamínula e adicionar o filtro seco para a lâmina de microscópio molhado com a solução Antifade. Mais uma vez, adicionar uma pequena quantidade de solução Antifade à lamínula e lentamente coloque-o em cima do filtro, certificando-se de se livrar de todas as bolhas que podem se formar. Congelar imediatamente os slides a -20 ° C até ser necessário (estes devem ser usados ​​dentro de alguns meses para evitar desbotamento e reduziu a contagem de vírus) Os vírus são enumerados usando microscopia de fluorescência (no nosso caso um microscópio Leica DMRXA) com um conjunto azul gama de filtros (λ Ex = 450-490 nm, λ Em = 510 nm com um filtro de supressão em λ = 510 nm). Cada filtro terá pelo menos 20 campos de vista contadas, certificando-se de quantificar vírus total de cada grade de campo para assegurar uma distribuição de vírus através da membrana do filtro. Taxas médias de recorrência do vírus da independente três repetições são então calculados e um desvio padrão é determinada a partir das taxas de produção. 5. Resultados representante Os dados brutos colhidos pela pesquisadora requer processamento matemático mínimo para gerar taxas de recorrência da abundância de vírus. O conjunto de dados primários resultantes deste estudo é a taxa de recorrência da abundância de vírus no subamostras das incubações. Estes resultados do formulário regressões independentes de vírus tempo vs abundância para cada uma das amostras. Para cada amostra, o incubações individuais atuam como um tratamento, por isso, completar três replicate-incubações o pesquisador pode calcular as taxas, bem como uma estimativa de variação (por exemplo, o desvio padrão) (ver Figura 1). Uma ressalva deste processo é que a redução na abundância invariável vírus leva a uma redução nas células hospedeiras na amostra que estão carregando o fardo de vírus. Para compensar esta perda, a enumeração de abundância de bactérias, tanto a fonte (a água do mar não filtrada ou água do lago) e T = amostra de incubação 0 são necessárias. Esta informação pode ser usada para explicar o percentual de células perdidas: supondo que o processo de redução da abundância de vírus não é seletiva a favor ou contra qualquer membro da comunidade microbiana, este fator pode então ser usada para estimar a taxa de produção em situ de vírus . Figura 1. A produção de amostras de vírus como partículas ao longo de um 10 horas de incubação em condições in situ por microscopia de epifluorescência. Foram coletados durante um bloom de fitoplâncton na costa da Nova Zelândia em setembro de 2008. Figura 2. Diagrama esquemático do processo de fluxo de trabalho para ensaio de produção de vírus. O processo começa com a ultrafiltração de água da amostra para gerar vírus sem água. Este é preenchido por um sistema de ultrafiltração. Em amostras de água paralelas são recolhidos a partir do mesmo local e os vírus livres passados ​​por um filtro, enquanto a comunidade microbiana (contendo uma mistura de células infectadas e não infectadas) é mantida. Esta comunidade é então ressuspendido em água livre de vírus e incubadas sob condições in situ. A taxa de recorrência do vírus é então monitorada para os próximos 10 horas para determinar as taxas de produção de vírus.