Сотрудничество культуры Модели Синегнойной палочки Биопленки выращенных на живые человеческие клетки дыхательных путей
Summary
Эта статья описывает различные методы выращивания<em> Синегнойной палочки</em> Биопленки на культуре человеческих клеток эпителия дыхательных путей. Эти протоколы могут быть адаптированы для изучения различных аспектов образования биопленки, включая визуализацию биопленки, окрашивание биопленки, измерительные колониеобразующих единиц (КОЕ) из биопленки, а также изучение биопленки цитотоксичности.
Abstract
Бактериальные биопленки, были связаны с целым рядом различных человеческих заболеваний, но биопленки развития, как правило, учились на неживых поверхностей. В этой статье мы описываем протоколы для формирования синегнойной палочки биопленок на человеческие клетки эпителия дыхательных путей (CFBE клетки), выращенных в культуре. В первый метод (называется статическое сотрудничеству культуры биопленки модели), П. палочки инкубируют с CFBE клетки, выращенные в качестве сливной монослоев на стандартные пластины для культуры ткани. Хотя бактерии очень токсичен для клеток эпителия, добавление аргинина задержки разрушение монослоя достаточно долго для биопленки сформировать на CFBE клеток. Второй метод (называется потоком сотовый сотрудничеству культуры биопленки Model), включает в себя адаптацию ячейки биопленки поток аппарат, который часто используется в биопленки исследования, для размещения стекло покровное поддержки сливающийся монослой CFBE клеток. Это монослоя засевают П. палочки и перистальтического насоса течет свежую среду по ячейкам. В обеих системах, бактериальные биопленки форме в течение 6-8 часов после прививки. Визуализация биопленки повышается за счет использования P. палочки штамма конститутивно выразил зеленый флуоресцентный белок (GFP). Статические и потоком сотовый сотрудничества культуре анализы биопленки модельных систем для раннего П. палочки заражения Муковисцидоз (МВ), легких, и эти методы позволяют различным аспектам П. палочки образование биопленки и вирулентность для изучения, в том числе биопленки цитотоксичность, измерение биопленки CFU, и окрашивания и визуализации биопленки.
Protocol
Discussion
Биопленки сообщества бактерий, которые образуются в ответ на стимулы окружающей среды. Эти экологические сигналы приводят к глобальным нормативные изменения внутри каждой бактерии, в результате связывания с поверхностью, агрегация, производство экзополисахариды и других фенотипов ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Г. О Тул для руководства и предложения при разработке этих моделей. Эта работа была поддержана фондом кистозный фиброз (ANDERS06F0 к GGA, STANTO07RO и STANTO08GA к BAS), Национального института здоровья (T32A107363 к GGA и R01-HL074175 к BAS), и Национального центра по исследованию ресурсов Центры медико-биологических исследований Совершенство (P20-Кобре RR018787 к BAS).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| FCS2 (Focht Live-Cell) chamber | Bioptechs, Butler, PA | 060319131616 | ||
| FCS2 chamber controller | Bioptechs, Butler, PA | 060319-2-0303 | ||
| 40 mm glass coverslips | Bioptechs, Butler, PA | PH 40-1313-0319 | ||
| MEM | Mediatech, Manassass, VA | #10-010-CV | ||
| MEM without phenol red | Mediatech, Manassass, VA | Mediatech, Manassass, VA |
References
- Anderson, G. G., Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O’Toole, G. A. In vitro analysis of tobramycin-treated Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived airway epithelial cells. Infect Immun. 76, 1423-1433 (2008).
- Bruscia, E. Isolation of CF cell lines corrected at DeltaF508-CFTR locus by SFHR-mediated targeting. Gene Ther. 9, 683-685 (2002).
- Cozens, A. L. CFTR expression and chloride secretion in polarized immortal human bronchial epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 10, 38-47 (1994).
- Hentchel-Franks, K. Activation of airway cl- secretion in human subjects by adenosine. Am J Respir Cell Mol Biol. 31, 140-146 (2004).
- Moreau-Marquis, S. The DeltaF508-CFTR mutation results in increased biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa by increasing iron availability. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295, 25-37 (2008).
- Kuchma, S. L., Connolly, J. P., O’Toole, G. A. A three-component regulatory system regulates biofilm maturation and type III secretion in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 187, (2005).
- Heydorn, A. Experimental reproducibility in flow-chamber biofilms. Microbiology. 146 (Pt 10), 2409-2415 (2000).
- Heydorn, A. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146 (Pt 10), 2395-2407 (2000).
- Anderson, G. G., Yahr, T. L., Lovewell, R. R., O’Toole, G. A. The Pseudomonas aeruginosa magnesium transporter MgtE inhibits transcription of the type III secretion system. Infect Immun. 78, (2010).
- Costerton, J. W. Overview of microbial biofilms. J Ind Microbiol. 15, 137-140 (1995).
- Hoiby, N., Frederiksen, B., Pressler, T. Eradication of early Pseudomonas aeruginosa infection. J Cyst Fibros. 4, 49-54 (2005).
- Ko, Y. H., Pedersen, P. L. Cystic fibrosis: a brief look at some highlights of a decade of research focused on elucidating and correcting the molecular basis of the disease. J Bioenerg Biomembr. 33, 513-521 (2001).
- Gibson, R. L., Burns, J. L., Ramsey, B. W. Pathophysiology and management of pulmonary infections in cystic fibrosis. Am J Respir Crit Care Med. 168, 918-951 (2003).
- Furukawa, S., Kuchma, S. L., O’Toole, G. A. Keeping their options open: acute versus persistent infections. J Bacteriol. 188, 1211-1217 (2006).
- Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O’Toole, G. A. Growing and analyzing static biofilms. Curr Protoc Microbiol. Chapter 1, Unit 1B 1-Unit 1B 1 (2005).
- O’Toole, G. A., Kolter, R. Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signalling pathways: a genetic analysis. Mol Microbiol. 28, 449-461 (1998).
- Gomez, M. I., Prince, A. Opportunistic infections in lung disease: Pseudomonas infections in cystic fibrosis. Curr Opin Pharmacol. 7, 244-251 (2007).
