İnsan Pankreas Kanseri Xenografts Kök Hücre İzolasyonu

1. Fare ile Hasat Xenografts Dulbecco'nun modifiye Eagle orta (DMEM)% 10 fetal buzağı serumu (FCS), penisilin-streptomisin, 200 U / ml kollajenaz tip IV ve 0.6 U / ml dispase ile desteklenmiş hücre disosiasyon tampon hazırlayın. Büyük çapı 1 cm den daha az bir subkutan insan pankreas kanseri xenograft barındıran bir atimik (nu + / nu +) fare, karbon dioksit boğulma ve servikal dislokasyon ötenazi. Subkutan bir tümör forseps ve makas kullanılarak künt diseksiyon ile fare kanadını hasat ve hemen hücre disosiasyon tampon yerleştirilir. Tümörler tartılır ve tümör dokusu 1 gram başına 10 ml hücre disosiasyon tampon içine yerleştirilir. 2. Tek hücreli bir Xenografts Süspansiyon oluşturun Steril bir biyogüvenlik kabini içinde çalışmak, tümör hücre disosiasyon tampon 1 ml ile 100 x 20 mm kültür kaplarına aktarılır. Tümörler mekanik steril Jilet ve forseps kullanılarak kıyılmış. Tümör hücre süspansiyonu, 5 ml serolojik pipetlemeyin ile 10 kez triturated. Tümör adet 5 ml serolojik pipetlemeyin tıkamaz kadar küçük olmalıdır. Tümör hücre süspansiyon hücre disosiasyon tampon kalan hacmi (% 50 daha az dolu) içeren 50 ml konik tüp ve 1 dakika boyunca maksimum hızda transfer vortekslenmiş. Tümör hücre süspansiyonu daha sonra, 37 ° C'de 2 saat boyunca her 20 dakikada bir 1 dakika aralıklı bir vorteks ile inkübe. 3. Hücre Doku Enkaz Süspansiyon ve Ölü Hücreleri İncelten 2 saatlik inkübasyondan sonra hücre süspansiyonu, 1 dakika boyunca maksimum hızda vortekslenmiş. Hücre süspansiyonu daha sonra 70 mikron filtre geçirilir ve yeni bir 50-ml konik tüp içinde toplanan ve nihai bir hacim başına 15 ml tüp şekilde ayarlanabilir. , Ölü hücreler ve doku artıkları daha da ayrı bir canlı hücreler, tümör hücre süspansiyonu Ficoll-Paque Plus kullanarak yoğunluğu santrifüj ayrılır. Ficoll-Paque Plus bir underlayment Ayrıca iki kat karıştırmak için dikkatli olmak hücre süspansiyonu altında yavaş yavaş 15 ml Ficoll-Paque pipeting tarafından oluşturulur. Hücre süspansiyon ve frenler ile 30 dakika Ficoll katmanları 500x g santrifüj kapalıdır. Ficoll Paque Plus ve hücre disosiasyon tampon arayüzü hücreler toplanır ve taze bir 50 mL konik tüp transfer. Taze DMEM% 10 FCS ile desteklenmiş sulandırmak için hücre süspansiyonu eklenir 01:03 (10 ml hücre süspansiyonu eklenir örneğin 20 ml taze medya). 10 dakika, dekante medya 450x g santrifüj hücreleri toplanır ve hücre pelletini ALDEFLUOR tampon 1 mL yeniden süspanse. On mikrolitre hücre süspansiyonu, 10 mcL tripan mavi ve canlı hücreler hemasitometre kullanarak sayılır ile seyreltilir. Bu adım sırasında, ölü hücreler ve doku artıkları çok sayıda not edilir, sonra yoğunluğu santrifüj hücre ayırma (3.7 adımlar 3,3) tekrarlanan olabilir. 4. Floresan Aktif Hücre Sıralama Hücreler Leke Olarak Etiket yedi 12 x 75 mm polistiren test tüpleri aşağıdaki gibidir: Lekesiz CD44 APC CD24-PE fare CD31-biotin + fare soyun-biotin + fare H-2Kd-biotin ALDEFLUOR ALDEFLUOR + DEAB + IgG 2bκ APC + IgG 2aκ-PE ALDEFLUOR + CD44 APC + CD24-PE + fare CD31-biotin + fare soy biotin + fare H-2Kd-biotin. ALDEFLUOR tampon 2 ml hücre süspansiyonu, 5-10 milyon hücreleri / ml bir final konsantrasyon seyreltilir ve buz üzerinde tutmak. Tüpler # 1, 2, 3, ve 4 hücre süspansiyonu 100 mcL ekleyin ve buz üzerinde saklayın. Tüp # 6 1 mcL DEAB ekleyin ve buz üzerinde tutmak. 1000 seyreltilmiş kalan hücre süspansiyonu ALDEFLUOR reaktif ekle kat (örneğin 1.6 ml hücre süspansiyonu 1.6 mcL ALDEFLUOR reaktif eklemek), iyice karıştırın ve buz üzerinde yer. Tüp # 7 100 tüpler # 5 ve 6 için bu karışımın mcL ve kalan karışımı (1.4 mL) aktarın. Tüm tüpleri 40 dakika boyunca 37 ° C su banyosunda inkübe edin. Hücrelerin tüplerin altına yerleşmesini önlemek için hücre süspansiyonu, her 10 dakikada bir karıştırın. Santrifüj 450x g hücreleri ve 4 ° C 10 dakika sonra tampon süzün. # 1 ve 5 100 mcL ALDEFLUOR tampon tüpler pelet yeniden süspanse edin. Tüpler # 2, 3, 4, ve 6 için aşağıdaki gibi seyreltilmiş uygun antikorları içeren ALDEFLUOR tampon 100 mcL ekleyin: IgG 2bΚ-APC, IgG 2aΚ-PE, CD44-APC, ve CD24-PE için 01:20antikorlar için 1:100 fare CD31-biotin, fare soy biotin ve fare H-2Kd-biotin antikorlar. # 7 tüpe 1.4 mL CD44 APC 1:20 seyreltme içeren ALDEFLUOR tampon, ve CD24-PE antikorları ve bir fare 1:100 dilüsyon CD31-biotin, fare soy biotin ve fare H-2Kd-biotin antikorlar. 10 dakika boyunca buz üzerinde hücre süspansiyonları inkübe edin. Santrifüj 450x g hücreleri ve 4 ° C 10 dakika sonra tampon süzün. Pelet tüpler # 1, 2, 3, 5, ve (6) 100 mcL ALDEFLUOR tampon tekrar ALDEFLUOR tampon 1:100 dilüsyon streptavidin-PerCP protein içeren 1,5 mL hazırlayın. Tüp # 4 100 mcL ekleyin ve tüp # 7 1,4 ml ekleyin. 10 dakika boyunca buz üzerinde hücre süspansiyonları inkübe edin. Santrifüj 450x g hücreleri ve 4 ° C 10 dakika sonra tampon süzün. Pelet tüpler # 1, 2, 3, 4, 5, ve (6) 200 mcL ALDEFLUOR tampon tekrar # 7, 2 mcg / ml propidium iyodür içeren ALDEFLUOR tampon 2,8 ml tüp pelletini tekrar. Tüpleri her zaman buz üzerinde tutun. 35 mikron filtre ile süzgeç kapaklar 12 x 75 mm polistiren test tüpleri kullanarak hücrelerin iletin. 5. Floresan Aktive Hücre Sıralama Kanser Kök Hücreler Isolate Bir FACSAria akış sitometresinin hücre sıralama için hazırlanmıştır. Tazminat kontrolleri tüpler # 1, 2, 3, 4, ve 5 hücreleri kullanılarak ayarlanır. Gates'in hücre mayoları toplamak için ileri ve yan dağılım parametreleri göre oluşturulur. Sigara fare (PerCP negatif) ve uygulanabilir (non-propidium iyodür boyanmış) hücreleri kullanarak kapılı FL-3 kanal. DEAB-tedavili hücrelerde (tüp # 6) ve FL-1 kanal kullanılarak oluşturulan ALDH + hücrelerin kapıları üzerinde toplanır. CD44 + CD24 + hücrelerin kapıları üzerinde toplanan FL-4 ve FL-2 kanallarını kullanarak ALDEFLUOR 2bΚ APC, IgG ve IgG 2aκ-PE (tüp # 6) ile boyanan hücreler kullanılarak oluşturulur. Hücreler,% 10 FCS ile desteklenmiş DMEM 1 mL içeren 12 x 75 mm polistiren test tüpleri toplanmıştır. Hücreler sıralanmış sonra, süzün 10 dakika, medya 450x g hücre süspansiyonu santrifüj ve 500 mcL taze DMEM hücreleri tekrar süspansiyon% 10 FCS ile desteklenebilir. Adım 3.8 'de açıklandığı gibi hemasitometre kullanarak sıralaması hücrelerinin sayısını. 6. Temsilcisi Sonuçlar Bu protokol ALDH + ve CD44 + CD24 + pankreas CSCS izolasyonuna yol açacaktır. Fare kökenli hücrelerin yüzdesi değişkendir, ama biz çoğu insan pankreas kanseri xenografts fare fare kullanılarak CD31-kökenli hücreleri, fare soy kokteyl, ve fare, H-2Kd biotin-konjuge antikor (Şekil 1A 20-60% içerdiğini buldular .) Aynı şekilde farklı xenografts her CSC nüfus sıklığı değişken, ancak genel olarak toplam hücre popülasyonunun% 1-4 ALDH + (Şekil 1B) ve% 0,2-5 CD44 + CD24 + (Şekil 1C) olduğunu bulduk. FACSAria makine sayıları FACSAria tarafından tespit hücresel olmayan parçacıklar nedeniyle sık sık yanlış beri rutin hemasitometre kullanarak elle sıralanmış hücreleri saymak. Şekil 1. Flow sitometri arsa pankreas kanseri xenograft belirli toplumlarda betimleyen (A) FL-3 kanal olumlu boyanma Hücreler (propidium iyodür + fare CD31 + fare soy + veya fare H-2Kd +) sadece izole olarak dışlanan uygulanabilir ve non-fare hücreleri türetilmiştir. (B) bir insan pankreas kanseri xenograft ALDH faaliyet ALDH1 inhibitörü diethylamino benzaldehit (DEAB) varlığı ve yokluğu ALDEFLUOR reaktifi kullanılarak flow sitometri ile ölçüldü. Kare DEAB ile muamele edilen hücreler alınarak oluşturulan ve daha sonra tedavi edilmezse hücrelere uygulanan ALDH + hücreleri tasvir kapıları temsil eder . ALDH + hücre yüzdeleri kapısı gösterilmiştir. (C) CD44 + CD24 + kapısı ALDEFLUOR ile boyanan hücreler göre oluşturulur ve IgG 2bκ-APC (CD44 APC için izotipik kontrol) ve IgG 2aκ-PE (CD24-PE için izotipik kontrol) antikorları oldu. CD44 + CD24 + hücrelerin yüzdeleri kapısı gösterilmiştir.